垂盆草配方顆粒的HPLC 指紋圖譜研究

★ 董玉娟 周敏 胥愛(ài)麗 李素梅

（1.廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院 廣州 510095）

垂盆草配方顆粒是采用符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的垂盆草飲片經(jīng)一系列的提取、濃縮、干燥、制粒等制備方法制粒而成，具有清熱解毒、利濕退黃功效。目前對(duì)垂盆草藥材、配方顆粒及含垂盆草藥材復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究大多采用薄層色譜法鑒別，高效液相色譜法或紫外吸收法測(cè)定含量［1-10］等，尚未見(jiàn)垂盆草配方顆粒指紋圖譜相關(guān)研究，且未見(jiàn)垂盆草配方顆粒與其飲片之間的關(guān)聯(lián)性研究。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）建立了垂盆草配方顆粒HPLC 指紋圖譜的分析方法，研究不同批次的樣品，并比較了配方顆粒與飲片之間的差異。本研究為垂盆草配方顆粒質(zhì)量的整體有效控制提供了科學(xué)方法與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters e2695-2998型高效液相色譜儀，Empower 2 數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)；SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm，5μm） 色 譜 柱；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器；Mettler XS205DU電子天平；MilliPore Advantage A10 自動(dòng)純水機(jī)。

1.2 試藥垂盆草藥材由廣東一方制藥有限公司提供，劉法錦研究員鑒定為景天科植物垂盆草Sedum sarmentosumBunge 的干燥全草；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；垂盆草配方顆粒（1.2g 相當(dāng)于15g 飲片）樣品購(gòu)于廣東一方制藥有限公司，批號(hào)見(jiàn)表1。

甲醇、乙腈為色譜純；液相用水為超純水；其余試劑均為分析純。

表1 垂盆草配方顆粒批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取4.46mg 蘆丁對(duì)照品，置于容量瓶中，加入甲醇制成每1mL 含44.6μg 蘆丁的對(duì)照品溶液，置冰箱內(nèi)保存，備用。

2.2 垂盆草配方顆粒供試品溶液的制備精密稱取樣品S1～S10 各約1.0g，置于錐形瓶中，加入25mL 50%甲醇，稱重，超聲處理30min，取出，放冷，補(bǔ)重，搖勻，取0.45μm 微孔濾膜續(xù)濾液。

2.3 垂盆草藥材供試品溶液的制備取10g 藥材，加入200mL 水，煮沸30min，蒸發(fā)至干，加1.0g 硅藻土攪拌均勻，置于錐形瓶中，同“2.2”項(xiàng)的方法制備垂盆草藥材供試品溶液。

2.4 色譜條件的建立采用Waters XbridgeTMC18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；以甲醇（A）- 0.4%磷酸（B）為基礎(chǔ)流動(dòng)相，研究了樣品提取方法、檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱、流動(dòng)相體系、柱溫及流速，以確立最佳色譜條件。

經(jīng)試驗(yàn)，建立本實(shí)驗(yàn)的最佳色譜條件為：SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇（A）- 0.1%磷酸（B），按表2 進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：265nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10μL。

表2 流動(dòng)相梯度

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)制備垂盆草配方顆粒供試品溶液（S7）并連續(xù)進(jìn)樣6 次。中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算6 次所得指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度均＞0.99；參照峰為指紋圖譜中的10 號(hào)峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 值均＜2%，表明測(cè)試儀器穩(wěn)定，精密度高。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品（S7）6 份，制備供試品溶液，并進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算6 次所得指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度均＞0.99；共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 值＜2%，表明該實(shí)驗(yàn)中建立的方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液（S7），分別于0、4、8、12、16、24h 進(jìn)樣。計(jì)算6 次所得指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度均＞0.99；共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 值＜2%，說(shuō)明供試品溶液在24h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 空白試驗(yàn)及對(duì)照試驗(yàn)將蘆丁對(duì)照品、垂盆草藥材以及垂盆草配方顆粒測(cè)得的HPLC 色譜圖進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)圖1-3，并且第22 號(hào)峰確定為蘆丁，配方顆粒與藥材的相關(guān)性較好。

圖1 蘆丁對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖2 垂盆草藥材HPLC色譜圖

圖3 垂盆草配方顆粒HPLC色譜圖

3 垂盆草配方顆粒指紋圖譜模型的建立

對(duì)10 批垂盆草配方顆粒指紋圖譜的色譜峰進(jìn)行匹配，匹配結(jié)果見(jiàn)圖4，得出共有模式色譜圖見(jiàn)圖5。共確定了25 個(gè)共有峰，其中10 號(hào)峰為參照峰。10 批樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-4。與共有模式相比，不同批號(hào)垂盆草配方顆粒樣品的相似度數(shù)據(jù)，見(jiàn)表5。

表3 10批垂盆草配方顆粒共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 10批垂盆草配方顆粒共有峰相對(duì)峰面積

圖4 10批垂盆草配方顆粒樣品指紋圖譜匹配色譜圖

圖5 不同批號(hào)垂盆草配方顆粒HPLC共有模式圖

表5 不同批號(hào)垂盆草配方顆粒樣品與共有模式比較的相似度

利用相似度評(píng)價(jià)軟件分析，得出垂盆草配方顆粒的HPLC 共有模式圖上有25 個(gè)共有峰。通過(guò)表觀分析，不同批號(hào)垂盆草配方顆粒都在6.8、7.4、8.8、9.4、13.0、15.3、21.6、23.7、24.2、26.9、28.1、34.2、38.5、40.2、41.3、49.3、57.1、65.9、70.2、83.3、88.0、90.4、91.0、93.3、94.9min 左右出峰，可以初步認(rèn)為這是不同批次垂盆草配方顆粒指紋圖譜共有峰的保留時(shí)間。

4 討論

（1）本實(shí)驗(yàn)考察了不同廠家的色譜柱，結(jié)合色譜圖的峰數(shù)、分離度、峰形、基線以及柱壓，最后選用SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm， 5μm）色譜柱為本實(shí)驗(yàn)用色譜柱。

研究流動(dòng)相體系時(shí)，甲醇-水流動(dòng)相獲得色譜峰的峰形與分離度較差，但在流動(dòng)相體系中加酸后的甲醇-0.4%磷酸流動(dòng)相，色譜峰的峰形得到改善，分離度良好；將甲醇換為乙腈按上述梯度進(jìn)行洗脫，色譜峰分離差。最后，研究了不同濃度的酸在流動(dòng)相中的作用，甲醇-0.4%磷酸與甲醇-0.1%磷酸的色譜圖基本一致，雖然兩種流動(dòng)相體系的pH 值均在色譜柱的適用范圍內(nèi)，但考慮到酸的量較大會(huì)對(duì)色譜柱有一定的損害，因此，最終采用甲醇-0.1%磷酸作為實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相體系。

（2）比較垂盆草配方顆粒與藥材的指紋圖譜，結(jié)果基本一致，表明配方顆粒與藥材有很好的相關(guān)性，臨床上可以代替藥材使用。另外，從每個(gè)批號(hào)的垂盆草配方顆粒的HPLC 色譜圖上看出，每個(gè)批號(hào)的垂盆草配方顆粒中成分大致一樣，但含量有所不同，這可認(rèn)為是與原料的生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間或制備工藝過(guò)程等因素影響有關(guān)。從表5 的相似度數(shù)據(jù)中，9 批樣品的相似度高于0.9，只有1 個(gè)批號(hào)樣品的相似度稍低于0.9，可能是由于投料所用垂盆草藥材與其余批號(hào)投料所用的垂盆草藥材產(chǎn)地及質(zhì)量不一樣所致，因此，原料藥材的來(lái)源應(yīng)在生產(chǎn)過(guò)程中固定，以保證垂盆草配方顆粒原料藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性，才能保證其配方顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定。