視網膜色素變性研究新進展

王 悅，徐國興

0引言

視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組遺傳性、致盲性視網膜疾病。RP的遺傳方式具有多樣性，主要有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳以及X連鎖遺傳，還有少部分為線粒體及雙基因遺傳[1]，臨床工作中也有發現較多的散發型病例。日本一項大規模的研究測序[2]表明EYS, USH2A, RP1L1, RHO, RP1和RPGR的突變是65.4% RP患者患病的原因。雖然RP具有遺傳異質性，但視錐及視桿細胞的凋亡而導致功能的喪失為共同的最終結果。該病的主要臨床癥狀為夜盲、進行性視野缺損，眼底檢查可見視盤蠟黃、視網膜血管變細、視網膜骨細胞樣色素沉著。 Sujirakul等[3]2a期間對71例RP患者進行隨訪觀察，發現超過75%的患者病情呈顯著的進展，且靠近黃斑中心凹時進展速度顯著減慢，支持RP以指數方式進展的理論，另發現有19%的患者左眼與右眼的病情進展有差異。

1 RP的分類

因RP的臨床表型和基因突變的相關性部分尚未明確，故其在診斷上及分類上還缺乏統一的標準，分類方式多樣[4]。(1)按有無明確病因分類: 原發性RP 和繼發性RP；(2)按有無家族遺傳史分類: 家族遺傳型RP，包括常染色體顯性遺傳RP、常染色體隱性遺傳RP、X 染色體連鎖遺傳型RP、雙基因遺傳、線粒體遺傳單純型RP；(3)按有無合并全身其他癥狀分類：單純型RP和綜合征型RP，綜合征型RP除具有單純型RP表現外，還可伴隨聽力喪失、前庭功能障礙、軀干性肥胖、多趾畸形、認知功能障礙等表現，以Usher綜合征和Bardet-Biedl綜合征(BBS)較為常見。

2新一代測序技術(NGS)在RP中的應用

RP主要是因基因突變引起，若想獲得良好的治療效果，必需要從病因入手。目前發現大于50個突變的基因與非綜合征型RP相關，12個突變的基因可導致Usher綜合征及17個突變的基因與Bardet-Biedl綜合征有關[5]。基因測序技術的發展為RP的分子生物學研究提供了極大的幫助，近年來RP基因的發現主要依靠新一代測序技術(NGS)[6]，雖然目前已經發展至第四代技術，但第二代測序技術仍是使用最多的技術，其又稱為高通量測序技術，主要原理[7]：第一步為構建 DNA 模板文庫，把DNA 固定在芯片表面或微球表面；第二步通過擴增形成 DNA 簇或擴增微球；最后利用聚合酶或者連接酶進行一系列循環的反應操作，通過CCD相機采集每個循環反應中產生的光學事件信息，從而獲得 DNA片段的序列。應用范圍主要包括以下3個方面：(1)基因組學；(2)轉錄組學；(3)表觀組學。第三代測序是在單細胞和單分子水平上進行基因組測序的新技術[8]。較二代測序技術相比，三代測序技術的優勢主要表現在：(1)測序通量高；(2)測序成本低；(3)讀取長度長；(4)測序時間短；(5)所需起始用量更少且精確性高[8]。第四代測序技術主要是納米孔測序，是利用不同堿基的電學性質差異，通過納米孔等直接對堿基穿過電極時的電流變化進行測序[9]。對于三種新一代測序技術，它們有各自的優點以及缺點，要使測序技術更好地應用于RP的分子診斷，關鍵在于合理評估以選擇合適的測序平臺。結合常規的Sanger測序和NGS的結果，使用粗略估計，可以檢測到20%～30%的隱性遺傳方式，60%～70%的常染色體顯性遺傳形式，80%～85%的X性連鎖遺傳形式[10]。因RP具有遺傳異質的特點，部分基因型-臨床表型的一致性尚不明確，國外文獻有報道利用系統化的NGS數據分析、Sanger測序驗證和分離分析來鑒定致病性突變，72例確診的致病性突變的患者中有58例攜帶已知LCA或少年RP基因的突變，并表現出相應的表型，而另外14例與他們最初的臨床診斷不符，在分子診斷的指導下，重新分類了2例患者的臨床診斷[11]。Zhao等[12]將來自北愛爾蘭的大量RP先證者應用于新一代基于測序的全面分子診斷的研究，研究表明分子信息可以幫助臨床診斷，可能幫助改變治療方案，并可用于家庭咨詢和管理。

3光感受器凋亡的途徑

視網膜中光感受器細胞有視錐細胞和視桿細胞2種，它們的凋亡是不同致病基因導致RP最終的共同機制。不同的基因缺陷可能通過以下途徑導致細胞凋亡[13]：(1)遺傳缺陷導致光感受器外節的正常結構不能形成或脫落，打破之間的平衡，影響正常的RPE與感光細胞間代謝物質的傳遞；(2)基因缺陷導致光電轉導異常，現在更多觀點認為該途徑紊亂, 引起高濃度cGMP, 作為信號分子介導了細胞凋亡；(3)基因缺陷影響RPE與光感受器的相互作用, 如視黃醛再生和RPE 對外節的內化、分解；(4)相鄰細胞之間誘導細胞凋亡，一些RP致病基因是在視桿細胞而不在視錐細胞中,但最終表現為視錐、視桿細胞的凋亡，其機制目前尚不明確，可能與凋亡細胞釋放細胞因子，或營養因子消失有關。Ma等[13]發現變性的光感受器可通過旁觀者效應擴散至周圍健康的細胞，錐體細胞對錐體細胞也具有殺傷作用。

4 RP的治療

4.1基因治療基因治療是把目的基因經載體轉至有基因缺陷的細胞內來替代致病基因的治療手段。基因治療的方法主要有以下4種。

4.1.1基因替代治療MFRP編碼未知功能的視網膜色素上皮(RPE)特異性膜受體。rd6小鼠是由Mfrp(膜型卷曲相關蛋白)基因突變引起的常染色體隱性遺傳的RP的天然模型，Dinculescu 等[14]應用酪氨酸-衣殼突變體scAAV8(Y733F)作為載體將目的基因導入rd6小鼠的視網膜下，發現對維持視網膜結構和功能均有效，且對于減緩光感受器變性以及防止異常吞噬細胞在視網膜下的特征性積聚也是有效的。Li等[15]為了防止Mfrprd6小鼠中的光感受器細胞死亡，在出生后第5d通過視網膜下注射AAV-Mfrp載體將目的基因轉導至右眼，左眼作為對照組，通過EGR檢測，右眼的視錐和視桿細胞的功能較左眼顯著增加，且右眼視網膜外核層厚度較左眼增加。以上2個實驗均說明基因治療是有效的，但目前多數研究都還只基于動物模型中。

4.1.2 RNA干擾技術RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導的，在轉錄后mRNA水平封鎖相應基因表達的新基因阻斷技術，在基因功能研究、基因治療方面已顯示出巨大的前景[16]，可用于抑制體外和體內特定基因的表達。對于其他組織及器官來說，眼球是相對密閉的，因此，目前認為眼睛是RANi治療的一個好靶點，可通過局部眼藥水點眼或注射遞送干擾RNA。Hernan 等[17]研究發現siRNA可能干擾順式作用剪接RHO轉錄物，在常染色體顯性遺傳的治療方法中應該考慮突變序列和不完全突變轉錄物消除的限制。

4.1.3核酶治療RP核酶是一類具有催化活性的RNA分子，通過催化靶位點RNA鏈中磷酸二酯鍵的斷裂，特異性地剪切底物RNA分子，從而阻斷靶基因的表達。Dir等發現核酶可區分與常染色體顯性RP相關的mRNA的突變型和野生型序列，同時描述了根據核酶切割的動力學和特異性它們會減少視桿細胞中異常視紫紅質的量并且可能具有作為抗遺傳疾病的治療劑的潛力[18]。

4.1.4抑制凋亡RP最終的表現是RPE細胞功能喪失和光感受器的凋亡，因此通過抑制細胞的凋亡可能會延緩或阻止病情的進展。Bcl-2基因即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因，是一種癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并且近年來的一些研究已開始揭示這一作用的機制。Nir等[18]將Bcl-2基因轉導至RP小鼠模型及rds小鼠中，觀察到實驗組與對照組相比，前者光感受器的數量是后者的2倍，表明Bcl-2表達可能是人類視網膜色素變成有效的治療策略。

4.2細胞移植目前細胞移植治療視網膜變性是眼科研究的熱點，國內外許多文獻報道將感光前體細胞或視網膜色素上皮細胞移植到視網膜下腔或玻璃體內,具有延緩光感受器的凋亡或替代凋亡的感光細胞的作用以挽救殘存的視覺功能及視網膜結構。主要的移植細胞來源是視網膜祖/干細胞、胚胎干細胞(ESC)和誘導多能干細胞(IPS)[19]，其中胚胎干細胞和誘導多能干細胞是多能的，可變為任何一種細胞。ESC來源于胚胎，而IPS細胞可來自各種組織，如皮膚、骨髓、牙齒。Li等[20]成功培養了來自成年小鼠的視網膜多能干細胞(RSC)，當把培養的視網膜多能干細胞移植到緩慢退化的rd7突變小鼠眼睛的視網膜下間隙后，他們發現RSC衍生的感光細胞可整合到視網膜中，且形態學上類似于內源性光感受器并與視網膜神經元形成突觸，當移植到光感受器缺陷型rd1突變小鼠(RP模型)的眼中時，RSC衍生的光感受器可部分恢復光響應，表明RSC衍生的光感受器是功能性的，因此這項研究已經證明，從成年小鼠視網膜分離的RSC具有產生功能性感光細胞的潛力，這些功能性感光細胞可以恢復RP和ARMD中光感受器細胞凋亡導致的視力喪失。國內文獻報道視網膜下移植骨髓間充質干細胞，具有抑制視網膜光感受器細胞凋亡的作用，原因可能是通過其分泌的 bFGF 細胞因子發揮多向分化潛能及營養支持的作用， 從而對光感受器細胞起到一定的保護作用[21]。

4.3視網膜假體視網膜假體根據視網膜電極放置的位置又可以分為：視網膜上假體、視網膜下假體和脈絡膜上腔假體。美國 Second Sight公司研發的Argus系列視覺假體是目前最有代表性的一類視網膜上假體[22-23]。Argus II 假體在2011 年、2013 年和 2014 年分別獲得歐盟、美國和加拿大FDA 的批準用于治療晚期RP患者，它是全球使用最廣泛的視網膜假體，具有迄今為止估計有250多例患者接受了植入。有文獻報道殘余視力為光感的患者可通過ArgusⅡ系統識別字母和單詞，表明可再現的空間分辨率，但仍有許多復雜的工程和生物物理障礙需要克服，人工視覺和自然視覺之間仍然存在的很大的差距[22]。

4.4藥物治療在視網膜中維生素A通過衍生物——視黃醛與視蛋白結合形成視紫紅質, 參與光電轉化反應, 產生視覺沖動。國內外許多文獻均報道過維生素A可減慢RP的病情進展。Berson等[24]對維生素A治療兒童RP進行回顧性研究，結果顯示維生素A棕櫚酸酯可減緩視網膜色素變性兒童視錐細胞功能喪失。二十二碳六烯酸(DHA)、牛磺酸、中藥治療RP均有報道過，但治療效果尚不明確。

4.5手術聯合藥物治療董玉萍等[25]對450例900眼RP患者應用雙眼自體血管取材側支循環建立術同時聯合給予抗菌素、曲克蘆丁、三磷酸腺苷，口服卵磷脂絡合碘片、樂丁、遞法明等藥物治療，取得了一定的治療效果。

4.6 RP合并黃斑水腫的治療RP偶爾會伴有脈絡膜新生血管(CNV)和黃斑囊樣水腫(CME)，可使RP復雜化，發生在10%～50%的患者中[26]。主要機制為：(1)血視網膜屏障的破壞;(2)RPE中泵功能缺失;(3)Müller細胞功能水腫和障礙；(4)抗視網膜抗體;(5)玻璃體牽拉。近年來隨著抗VEGF藥物的出現，有研究者發現其治療RP繼發的CME可有效減輕水腫，Manabu[27]對1例56歲的患者進行了連續8a的抗VEGF藥物治療，期間未觀察到視野進行性喪失。國內一項研究[28]報道對6例10眼RP合并CME患者進行雷珠單抗注射，9眼黃斑區多焦電生理的峰值術后恢復至正常水平,1眼改變不明顯。隨訪期間2眼有一過性眼壓升高,余未見其他并發癥發生。也有研究者提出RPE細胞可分泌VEGF，RP合并CME的患者應慎用抗VEGF藥物,因此關于抗 VEGF對RP繼發的CME治療的安全性仍需要進一步評估。因自身免疫反應也可參與RP繼發 CME，故糖皮質激素對該病可能也會起到一定的作用。Alhassan 等[29]對 1 例應用碳酸酐酶抑制劑治療無效的患者，實施雙眼玻璃體腔內注入地塞米松后，患者BCVA及黃斑中心凹厚度均得到改善，但在治療后的2mo患者病情復發。

5小結

RP是眼科中常見的遺傳性眼病，目前發病機制及治療方法仍處于探索的過程中，雖然各種治療方法均有報道，但許多都還只是在動物模型上研究得到的結論，要想用于臨床治療人類RP，可能還要經過一段很長并坎坷的路。要想攻克RP這一遺傳性眼病，不僅需要眼科醫生的不懈努力，也需要遺傳學家、流行病學家等的付出，更關鍵的是他們之間的合作與交流。