我國部分地區絨山羊乏質體感染情況調查

胡群山，王坤輪，史 柯，寧曉冬，菅復春，索 勛

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002；3.河南應用技術職業學院，河南 鄭州 450042)

絨山羊是我國的一種獨特的生物資源，其所產的山羊絨具有顏色潔白如玉、細而柔軟等特點，因此被美譽為“纖維寶石” 和“軟黃金”，具有重要的經濟價值；我國羊絨總產量為18 000噸，約占世界羊絨總產量的75%，是世界上的產絨大國，對發展我國經濟、增加農民收入做出了巨大貢獻。

乏質體病(又稱無漿體病)是一種對人和動物造成嚴重危害的具有公共衛生學意義的細胞內專性寄生性蜱傳血液傳染病[1-2]。目前公認的邊緣乏質體(A.marginale)、中央乏質體(A.centrale)、嗜吞噬細胞乏質體(A.phagocytophilum)、綿羊乏質體(A.ovis)、牛乏質體(A.bovis)、扁平乏質體(A.platys)及近年發現的山羊乏質體(A.capra)可以對人和各種動物(牛、羊、犬、鼠等)及特定細胞(單核細胞、中性粒細胞、紅細胞等)產生危害[3-4]；其中嗜吞噬細胞乏質體于1994年在美國被確定可以造成人粒細胞乏質體病(Human granulocytic ehrlichia，HGE)[5]；綿羊乏質體的變種在2007年首次被確定也可引起人的粒細胞乏質體病[6]。該病目前被廣泛報道，已成為在世界范圍內廣泛流行的一種在經濟上較為重要的動物性疾病，并被世界衛生組織(World Health Organization，WHO)列為綿羊、牛等動物檢疫的主要疫病之一[7-8]。我國自20世紀80年代在絨山羊中檢測到乏質體以來，目前在內蒙古、河南、山西、遼寧、云南、山東、西藏、新疆等地區山羊及綿羊中均檢測到某些種的乏質體，嚴重制約我國養殖業的發展[9-10]。

為了解我國西北地區絨山羊乏質體病的流行及分布情況，并為該病的綜合防控提供依據，本試驗用巢氏PCR方法對甘肅、河北、內蒙古、山西、陜西及新疆共6個地區的乏質體感染情況進行了調查。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 387份絨山羊血液樣品，于2016年5～11月采自甘肅、河北、內蒙古、山西、陜西及新疆共6個地區的絨山羊養殖場。逐只經頸靜脈采血，每只絨山羊血液樣品 2 mL 置EDTA-K2抗凝管內，裝入冰盒內帶回實驗室，置4 ℃冰箱內保存待檢。

1.2 主要儀器及試劑 血液基因組DNA提取試劑盒(OMEGA,Norcross,GA,美國)；PCR儀(ABI，美國)；凝膠成像分析系統(SYNGENE，英國)；DYY-5型穩壓穩流電泳儀及JY系列電泳槽(北京市六一儀器廠)；ddH2O、rTaqDNA Polymerase、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、LATaqDNA Polymerase、10×LA PCR Buffer、6×DNA Loading Buffer；DL-2 000 DNA marker等(TaKaRa，日本)。

1.3 DNA提取 按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。

1.4 PCR擴增 基于A.phagocytophilum的16S rRNA 基因，A.bovis的16S rRNA基因，A.ovis的msp4基因對所采集的血液樣品進行PCR擴增，引物名稱、序列及反應條件見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。每次PCR擴增均設陽性、陰性對照，PCR產物均在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳。

表1 乏質體PCR所用引物及擴增條件Table 1 Primers and amplification conditions used for Anaplasma PCR

1.5 數據分析 利用SPSS 22.0軟件對不同地區、不同飼養模式、不同年齡及不同性別絨山羊的乏質體陽性率差異情況進行卡方檢驗(χ2test)，P<0.05表示差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR檢測結果 利用引物SSAP2f/SSAP2r、AB1f/AB1r、MSP4f/MSP4r對采集的387份絨山羊血液DNA樣品進行PCR擴增，結果檢測出A.phagocytophilum、A.bovis、A.ovis三種乏質體，片段長度大小與預期一致(641 bp、551 bp、584 bp)(見圖1、2、3)。

圖1 A.phagocytophilum 16S rRNA基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of A.phagocytophilum 16S rRNA geneM：DNA標準DL2000；1～19：PCR產物；20：陽性對照；21：陰性對照M:DNA marker DL2000;1～19：PCR product;20：Positive control;21:Negative control

2.2 不同地區絨山羊血液乏質體感染情況 調查結果(見表2)顯示，絨山羊血液乏質體總陽性率為82.4%(319/387)，其中甘肅、河北、內蒙古、山西共4個地區乏質體陽性率均高達100%，陜西和新疆乏質體陽性率稍低，分別為70.6%和63.8%，表明不同地區絨山羊血液乏質體總陽性率統計學差異性顯著(χ2=48.747，P<0.05)。A.phagocytophilum、A.bovis和、A.ovis的陽性率分別為24.0%、34.1%和76.5%，不同種乏質體陽性率存在顯著差異(χ2=212.972，P<0.05)。

圖2 圖2 A.bovis 16S rRNA基因PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of A.bovis 16S rRNA geneM：DNA標準DL2000;1～19：PCR產物;20：陽性對照;21:陰性對照.M:DNA marker DL2000;1～19:PCR product;20:Positive control;21:Negative control

圖3 A.ovis msp4基因PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of A.ovis msp4 geneM:DNA標準DL2000；1～9:PCR產物；10:陽性對照；11:陰性對照；13～23:PCR產物M:DNA marker DL2000;1～9:PCR product;10:Positive control;11:Negative control;13～23:PCR product

表2 不同地區絨山羊血液中乏質體感染情況Table 2 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats from different regions (%)

2.3 不同飼養方式絨山羊血液乏質體感染情況 結果(見表3)顯示，舍飼、放牧及舍飼+放牧3種飼養方式下乏質體的陽性率分別為77.9%、9.2%和98.6%；舍飼+放牧方式飼養的絨山羊，其3種乏質體的陽性率均顯著高于舍飼和放牧的絨山羊。不同飼養方式下乏質體陽性率統計學差異性顯著(χ2=16.095，P<0.05)。

表3 不同飼養方式絨山羊血液乏質體感染情況Table 3 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different feeding styles (%)

2.4 不同年齡絨山羊血液乏質體感染情況 大于12月齡的羊乏質體陽性率高達93.9%，3～6月齡的絨山羊乏質體陽性率最低為65.7%，不同年齡下羊群乏質體陽性率統計學差異顯著(χ2=26.88，P<0.05)。不同年齡絨山羊血液乏質體感染情況見表4。

表4 不同年齡絨山羊血液乏質體感染情況Table 4 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different ages (%)

2.5 不同性別絨山羊血液乏質體感染情況 雌性絨山羊及雄性絨山羊乏質體的陽性率分別為85.1%、78.1%，差異不顯著(χ2=3.058，P>0.05)。不同性別絨山羊血液乏質體感染情況見表5。

表5 不同性別絨山羊血液乏質體感染情況Table 5 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different genders (%)

2.6 絨山羊血液中乏質體混合感染情況 387份絨山羊血液樣品中同時檢出2種及其以上乏質體者占25.3%(98/387)，不同種乏質體混合感染情況見表6。

表6 乏質體混合感染情況Table 6 The mixed infection of Anaplasmas

3 討論

3.1 乏質體感染在不同省區普遍存在且存在差異 孫明等[15]使用PCR方法檢測甘肅省景泰縣羊的乏質體感染率為30.6%。Liu等[16]調查發現，山羊的乏質體在不同地區流行情況存在差異，河南省感染率最高(39.1%)，貴州較低(22.0%)。Zhou等[17]對重慶的調查發現，山羊的乏質體的感染率為34.94%。本試驗對387份絨山羊血液樣品檢測發現，乏質體總陽性率為82.4%(319/387)，高于我國其他多數地區及先前的報道，可能與所調查的絨山羊地處牧區或山區，生態環境和地形地貌復雜、植被豐富，利于硬蜱的孳生與繁衍，絨山羊易受到硬蜱的侵襲、叮咬而致乏質體感染率較高，也可能與樣品采集時間正值硬蜱活躍季節有關。

3.2 放牧及舍飼+放牧絨山羊乏質體感染率較高 目前，關于放牧羊群乏質體病的報道較多，而舍飼及舍飼+放牧的較少。張菲菲[18]調查發現，放牧模式下的羊乏質體感染率(59.92%)明顯高于舍飼模式羊(36.75%)。張文靜等[19]調查發現，放牧奶山羊乏質體感染率(48.20%)顯著高于舍飼奶山羊(1.24%)。本調查發現，放牧及舍飼+放牧絨山羊乏質體感染率(分別為79.2%、98.6%)高于舍飼絨山羊(77.9%)，與前人調查結果一致，可能與乏質體作為蜱傳病原，放牧及舍飼+放牧的飼養方式增加了硬蜱接觸、叮咬羊而傳播乏質體所致，因此在養羊生產中應加強硬蜱的防控，但舍飼+放牧絨山羊乏質體感染率顯著高于放牧和舍飼絨山羊，是否與放牧與舍飼飼養方式轉換降低絨山羊抗病力或與檢測樣品量較小有關，有待進一步探討。

3.3 不同年齡絨山羊乏質體感染率存在顯著差異 呂亞莉[20]調查發現，<1歲的幼齡羊乏質體感染率(34.70%)低于>1歲的大齡羊(43.41%)。Zhou等[17]調查發現，<1歲的山羊乏質體感染率(29.34%)低于>1歲的羊(37.96%)。本次調查結果也顯示，不同年齡段羊群乏質體陽性率差異性顯著(χ2=26.88，P<0.05)，>1歲的羊群乏質體感染率最高，為93.9%，顯著高于其他年齡段的羊。可能由于隨著羊的年齡增加，羊一次或多次被硬蜱叮咬而感染，但未得到及時有效治療而長期攜帶乏質體所致。

3.4 不同性別絨山羊乏質體感染率差異不顯著 Zhou等[17]調查表明，雄性山羊乏質體感染率(37.23%)與雌性山羊(34.03%)不存在顯著差異。本次調查結果顯示，雖然雌性絨山羊乏質體感染率(85.1%)高于雄性絨山羊(75.1%)，但差異不顯著。

本調查結果表明，絨山羊乏質體感染在甘肅、河北、內蒙古、山西、陜西和新疆6省區廣泛存在且流行情況較為嚴重，如甘肅、河北、內蒙古、山西4個地區乏質體陽性率均高達100%，尤其嗜吞噬細胞乏質體作為一種人獸共患病病原，對公共衛生安全和人類健康構成潛在威脅，因此，應高度重視絨山羊乏質體病的防控和滅蜱工作，以保障人和動物健康及養羊業的健康快速發展。