N-氨甲酰谷氨酸對(duì)奶牛抗氧化性能及激素的影響

趙相洋，鐘友剛

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

我國(guó)現(xiàn)有奶牛存欄量約450萬(wàn)頭，75%以上品種為荷斯坦奶牛，全國(guó)奶牛產(chǎn)奶總量約為3 210萬(wàn)噸[1]。降低飼料成本是提升經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate，NCG)分子式為C6H10N2O5，屬于內(nèi)源性精氨酸補(bǔ)充劑，現(xiàn)代制備工藝改進(jìn)為以谷氨酸等為原料,經(jīng)過(guò)親核加成反應(yīng),重結(jié)晶制得[2]。NCG具有性質(zhì)穩(wěn)定以及經(jīng)濟(jì)成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，具有大范圍推廣和實(shí)用的意義。高產(chǎn)奶牛由于較快的生產(chǎn)管理節(jié)奏及其生理特性易發(fā)生氧化應(yīng)激。奶牛在氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，乳腺組織中抗氧化功能參與重要的防御機(jī)制，乳房炎相關(guān)疾病的病理變化與花生四烯酸等炎性因子表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[3]。奶牛體內(nèi)含有大量抗氧化活性酶類如血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione-peroxidase，GSH-Px)等，可主動(dòng)結(jié)合并清除自由基。飼料添加劑可使得動(dòng)物血清抗氧化指標(biāo)有較明顯的提高，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基的抗性[4]。在胚胎發(fā)育的調(diào)控中，胰島素(Insulin，INS)以及生長(zhǎng)激素(Growth hormone，GH)都發(fā)揮著不可或缺的作用；此類激素對(duì)奶牛的生產(chǎn)繁育，以及經(jīng)濟(jì)動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)改善有廣泛的實(shí)用意義[5-6]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 NCG，購(gòu)自亞太興牧北京科技有限公司；GSH-Px測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，A-TOC)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；促乳素(Prolactin，PRL)、INS、GH試劑盒，均購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司。

1.2 主要儀器 酶標(biāo)檢測(cè)儀，購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器公司；放射免疫計(jì)數(shù)器，購(gòu)自西安核儀器廠；離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó) Corning 公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物均來(lái)自天津夢(mèng)得奶牛場(chǎng)，年齡在1～4歲，選用牛場(chǎng)體重、胎次、產(chǎn)奶天數(shù)相近的健康、繁殖機(jī)能正常荷斯坦雌性奶牛60頭。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 荷斯坦奶牛60頭,隨機(jī)分為4組，每組15頭，編號(hào)具體到每頭牛；基礎(chǔ)飼料以家畜禽營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(National research council nutrient requiremenys of poultry，NRC)奶牛營(yíng)養(yǎng)需要為參照，配制全混合日糧(Total mixed ration，TMR)。試驗(yàn)圈內(nèi)放養(yǎng)，每日9：00或14：00奶牛出欄擠奶后，采食時(shí)將各組稱量好重量的NCG粉末混勻于飼料中任其采食，自由飲水。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)TMR，試驗(yàn)組分別為NCG 15 g/d組(飼喂基礎(chǔ)TMR并添加NCG 15 g/d)，NCG 20 g/d組(飼喂基礎(chǔ)TMR并添加NCG 20 g/d)，NCG 25 g/d組(飼喂基礎(chǔ)TMR并添加NCG 25 g/d)。從配種前30天起到配種后30天進(jìn)行分組飼喂，為期60 d。

1.4.2 血清激素及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 試驗(yàn)動(dòng)物飼喂NCG后，分別于0、30 d和60 d尾靜脈采血，共計(jì)3次采樣，每次血樣5.0 mL各2管，立即3 500～4 000 r/min離心5 min，分離血清，根據(jù)血清質(zhì)量篩選出180個(gè)樣本。采用比光法檢測(cè)0 d與60 d血清樣本，使用比光法試劑盒檢測(cè)血清中MDA、A-TOC等抗氧化指標(biāo)；用放射免疫分析法對(duì)0、30 d和60 d血清樣本進(jìn)行PRL、GH、INS含量的測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS(Version17.0,chicago,USA)進(jìn)行單因素 ANOVA 檢驗(yàn)及卡方分析，選擇最小差異性顯著法(Least significant difference,LSD)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 飼喂NCG對(duì)奶牛血清抗氧化指標(biāo)的影響 如表1所示，與對(duì)照組相比，NCG 15 g/d組GSH-Px升高13 U/dL，總抗氧化能力升高2.47 U/mL，均存在顯著差異(P<0.05)；MDA含量低于對(duì)照組，但差異不顯著。與對(duì)照組相比，NCG 25 g/d組GSH-Px提高20 U/dL，總抗氧化能力提高1.06 U/mL，均差異顯著(P<0.05)；與對(duì)照組相比，丙二醛濃度略升高，但差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)NCG添加劑量為20 g/d時(shí)，A-TOC、GHS-Px濃度最高，MDA濃度最低。綜上所述，不同濃度NCG飼喂60 d，NCG 20 g/d組的抗氧化指標(biāo)顯著高于對(duì)照組及其他劑量試驗(yàn)組。表明NCG對(duì)奶牛的抗氧化應(yīng)激指標(biāo)呈劑量相關(guān)性，每頭牛添加 20 g/d NCG能夠有效提高奶牛抗氧化能力。

表1 飼喂不同濃度NCG奶牛血清抗氧化指標(biāo)Table 1 Serum antioxidant indexes of cows fed with different concentrations of NCG

2.2 飼喂NCG對(duì)奶牛血清激素含量的影響

2.2.1 對(duì)血清PRL的影響 如表2所示，NCG 15 g/d組奶牛血清PRL顯著高于對(duì)照組及其他濃度飼喂組，血清PRL含量為(198.21±15.42)μIU/mL(P<0.01)，表明添加NCG 15 g/d有利于奶牛PRL的生成。添加NCG劑量為20 g/d時(shí)，血清PRL濃度低于對(duì)照組16 μIU/mL，差異不顯著(P>0.05)；NCG 25 g/d組血清PRL略低于對(duì)照組，但不存在顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，添加15 g/d NCG 能夠有效提高奶牛血清PRL濃度。

2.2.2 對(duì)血清GH的影響 如表2所示，NCG 20 g/d組在60 d，血清GH濃度為(1.03±0.04)ng/mL，顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，表明添加 20 g/d有利于奶牛生長(zhǎng)激素的生成。添加NCG劑量為25 g/d 時(shí)，血清GH比對(duì)照組高出0.22 ng/mL，差異顯著(P<0.05)。NCG 15 g/d組血清PRL濃度比對(duì)照組低0.03 ng/mL，但不存在顯著的差異(P>0.05)；表明添加20 g/d NCG能夠有效提高奶牛血清GH濃度。

2.2.3 對(duì)血清INS的影響 如表2所示，NCG 20 g/d組在60 d時(shí)，血清INS極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；NCG 25 g/d組，60 d時(shí)高于對(duì)照組0.22 μIU/mL，差異顯著(P<0.05)。表明添加 20 g/d、25 g/d有利于奶牛血清INS的生成。NCG 15 g/d組血清INS濃度，與對(duì)照組相比較偏低，且存在顯著的差異(P<0.05)；綜上所述，添加20 g/d NCG 能夠最有效提高奶牛血清INS濃度。

表2 飼喂NCG對(duì)奶牛血清激素含量的影響Table 2 Effect of feeding NCG on serum hormone content of cows

3 討論

綜上所述，奶牛基礎(chǔ)日糧中添加NCG能夠有效增加奶牛的抗氧化應(yīng)激能力，效果呈劑量相關(guān)性，添加20 g/d NCG時(shí)效果相對(duì)最佳。奶牛基礎(chǔ)日糧中添加NCG能夠有效提高奶牛生長(zhǎng)激素、促乳素、胰島素的分泌，添加20 g/d NCG時(shí)，綜合效果最佳。

本試驗(yàn)中，NCG提高動(dòng)物抗氧化能力的機(jī)制，一方面可能由于促進(jìn)了精氨酸內(nèi)源性生成，進(jìn)一步生成下游產(chǎn)物NO，中和了血清中的ROS氧自由基發(fā)揮作用；同時(shí)，精氨酸對(duì)于抑制脂質(zhì)氧化，也能直接發(fā)揮功效。這2種作用機(jī)制都能有效的降低血清中的氧化性物質(zhì)，使得原有的抗氧化酶等成分消耗減少，總抗氧化能力提高。不同時(shí)間段奶牛抗氧化指標(biāo)的變化規(guī)律與秦敏等研究相符[7]，且添加劑的使用對(duì)其有明顯改善。NCG對(duì)抗氧化能力的影響具有劑量相關(guān)性，可能由于NO在機(jī)體中本身就存在，不斷地生成和利用循環(huán)使得NO的含量處于平衡，而機(jī)體消耗NO的能力有限。在飼料中添加NCG，已被證實(shí)在小鼠中能夠提高小鼠的生長(zhǎng)性能[8]。精氨酸對(duì)精子在體成熟和發(fā)育具有一定作用，能緩解生精細(xì)胞的不良應(yīng)激[9]。添加20 g/d NCG 能夠最有效提高奶牛血清GH和INS濃度，對(duì)比陳六生等的試驗(yàn)結(jié)果[10]，泌乳作用與之相符。

NCG奶牛泌乳的作用可能是通過(guò)促進(jìn)GH、INS、PRL分泌發(fā)揮的。除此之外，也可能由于NCG的間接產(chǎn)物NO能通過(guò)影響血管內(nèi)皮系統(tǒng)，改善乳房組織血液灌流和血管通透性發(fā)揮的。在一定濃度范圍內(nèi)，此類激素的分泌與泌乳以及育肥增重存在明顯的正相關(guān)性[11]。對(duì)于不同激素分泌的影響，添加NCG最佳劑量有一定差別。正常情況下，由于胚胎著床和胚胎早期發(fā)育主要在配種后42 d以內(nèi)，在胚胎著床階段，妊娠對(duì)母體養(yǎng)分需求急劇升高，胚胎的平均丟失率高達(dá)30%以上[12-13]。此外，在多胎動(dòng)物中會(huì)使子宮容量不足引發(fā)流產(chǎn)。在圍產(chǎn)期以及妊娠等特殊時(shí)期，應(yīng)當(dāng)注重營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控，合理變更精料配比及使用添加劑[14]。

N-氨甲酰谷氨酸目前主要集中于應(yīng)用性研究，現(xiàn)階段對(duì)NCG的研究尚處于基礎(chǔ)階段，雖然大量試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了NCG具有一定的臨床效果和實(shí)用意義，但其發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制有待深入研究，相關(guān)研究有助于與獸醫(yī)產(chǎn)科、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)等細(xì)分領(lǐng)域之間理論相互結(jié)合。