松材線蟲生防真菌伊氏線蟲菌研究進展*

茅裕婷 馬 濤 藍來嬌 溫秀軍

(華南農業大學林學與風景園林學院 廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室 廣州 510642)

松材線蟲病(Bursaphelenchusxylophilus)又稱松樹萎蔫病，是一種能造成松林快速枯萎死亡、對森林資源造成嚴重危害、給國民經濟帶來極大損失的全球檢疫性和毀滅性流行病害(潘宏陽等， 2009； Vicenteetal., 2012)。松材線蟲病致病因子為松材線蟲，并通過人為因素和媒介天牛等進行傳播擴散(Zhaoetal.， 2008； 張星耀等， 2011)。目前，主要從其病原松材線蟲和傳播媒介松褐天牛(M.alternatus)2個方面，實行預防為主，結合物理、化學和生物防治對松材線蟲病進行綜合治理，但都沒能控制和拔除疫區(Leeetal.， 2003； 劉剛， 2006； 仇輝康， 2015)。

目前生防微生物和植物性殺線蟲物質被用于生物防治松材線蟲，并得到了廣泛的研究(Olibeiraetal.， 2004； 袁永平等， 2010； 姚伍等， 2018)。伊氏線蟲菌(Esteyavermicola)又稱伊氏殺線真菌和蠕蟲埃斯特菌，是第一個被記錄的內寄生松材線蟲的真菌，對松材線蟲表現出高侵染性和寄生率，具有作為抗松材線蟲病的生物防治劑的前景和潛力，在美國和韓國均獲得專利(Liouetal.， 1999； Tzeanetal.， 2001； Fangetal.， 2010； 王婷婷等， 2014a； 王瑞珍， 2017)。目前，應用伊氏線蟲菌進行松材線蟲病防治引起越來越多的關注，本文綜述了伊氏線蟲菌的最新研究進展，并簡要討論其在未來松材線蟲病生物防治中的應用潛力以及研究方向，以期為國內廣大生物防治工作者提供參考，推動該菌在生物防治松材線蟲病上的推廣應用。

1 發現

Liou等(1999)在被松材線蟲侵染的黑松(Pinusthunbergii)心材木片上發現了一個寄生于松材線蟲的新屬新種真菌，并將其命名為Esteyavermicola，這是首次對該菌的報道，菌株號為ATCC74485，為模式種。2000年，在捷克的正毛束小蠹(Scolytusintricatus)及其所在的橡樹(Querqus)坑道中第2次分離出了伊氏線蟲菌，菌株號為CBS115803(Kubátováetal.， 2000)。2006年，在韓國清道郡松林土壤里被侵染的腐生線蟲中第3次分離得到伊氏線蟲菌，菌株CNU120806(Wangetal.， 2008)。2014年，在天津從巴西進境木質包裝材料截獲的魯爾夫傘滑刃線蟲(B.rainulgi)中分離出1株內寄生真菌菌株NKF13222，經過鑒定確定其為伊氏線蟲菌的一個新菌株(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。此外，伊氏線蟲菌還有2個菌株，由皇家荷蘭生物科技研究所培養物保藏中心(CBS)1982年分離于日本的菌株CBS156.82和1998年于意大利的菌株CBS100821，這2株菌株在伊氏線蟲菌被命名和詳細描述之前一直被命名為其他名字，因此幾乎不為人所知(Wangetal.， 2009a)。目前，已發現的6個菌株(表1)分別來自于東亞、歐洲和南美洲，該真菌作為松材線蟲的內寄生性天敵，可能遍布在全球范圍內。

從形態學特征和侵染模式對幾個菌株進行區分：CNU120806與ATCC74485、 CBS115803相似，NKF13222與ATCC74485相似，但NKF1322與CBS115803、CNU120806在孢子形成和孢子萌發方式上有差異(Wangetal.， 2009a； 王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)?；?個基因序列β-tubulin和EF1-α構建的系統發育樹顯示ATCC74485和NKF13222有更近的親緣關系(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。通過28S rRNA基因序列分析，CBS115803和CNU120806有100%的同源性，在親緣關系上最近(Wangetal.， 2009a)。

2 形態特征與生物學特性

伊氏線蟲菌是真菌界(Fungi)子囊菌門(Ascomycota)子囊菌綱(Ascomycetes)肉座菌目(Hypocreales) Ophiostomataceae 科Esteya屬唯一的種。各菌株形態特征比較見表2。

表1 伊氏線蟲菌的6個分離株的詳細信息Tab.1 Details on the six E. vermicola isolates available to date

表2 4個E. vermicola菌株的形態特征比較Tab.2 Comparison of morphological characteristics of 4 E. vermicola strains

3 侵染機制

3.1 孢子萌發方式

不同菌株伊氏線蟲菌的孢子萌發方式不同(表2)。伊氏線蟲菌在固體培養基中培養時，月形孢子一般從孢子凹面中間處萌發并產生1個或多個芽管，接著芽管分枝形成營養菌絲，但有時月形包子也會在孢子凸面中間處萌發。桿狀孢子一般從孢子1/3～1/2處萌發并可產生1到多個芽管，但有時桿狀孢子也會從孢子端部萌發，其與鉤絲孢屬真菌產生的附著胞相似。伊氏線蟲菌在PDB液體培養基中培養時，會產生圓形、卵形或長橢圓形等不同形態的芽生孢子。芽生孢子出芽方式多變，可以再萌發產生芽孢，或者發芽后形成細長的柄，在柄上產生黏性孢子； 也可以萌發產生其他芽孢后，通過分化產生瓶梗狀產孢細胞和黏性孢子； 還可以1個芽胞2邊發芽形成2種產孢細胞并著生不同的分生孢子。在WA培養基上接種液體培養產生的芽生孢子會直接在芽孢上產生可黏附線蟲的黏性孢子或者繼續出芽聚集形成芽孢堆； 有些芽生孢子會發芽萌發延伸為菌絲并著生著瓶梗，于瓶梗上產生黏性孢子(曾顯雄， 2003)。目前，可通過中性紅和亞甲藍的混合物對孢子進行染色來快速評估伊氏線蟲菌分生孢子的活性，染色后活細胞中的細胞質呈紅色，細胞壁呈藍色染色，而死細胞的細胞質呈藍色(Wangetal.， 2014b)。

3.2 孢子黏附侵染機制

伊氏線蟲菌侵染松材線蟲的過程和機制： 線蟲在菌落中游走時碰到月形孢子凹面，月形孢子立即黏附于線蟲體表，并從產孢梗上脫落，隨著線蟲移動。月形孢子以凹面隨機黏附到線蟲體表任何部位，但分布最多的是線蟲頭部，然后是尾端，最少的是線蟲身體中部。月形孢子黏附線蟲體表16～24 h后，從孢子狀構造處開始分化產生侵入釘，穿透黏著層壓迫線蟲體壁，接著侵入釘穿透線蟲體壁的角質層及肌肉層，逐漸膨大形成菌絲體釋放到線蟲體內。之后，菌絲體吸取線蟲細胞營養生長，形成同化菌絲，并產生分支，在線蟲體內蔓延生長。隨著菌絲的生長，線蟲移動減慢，活性降低，黏著48 h后，菌絲擠破線蟲體壁向外長出，3～4天后的菌絲開始生長、分枝并蔓延，6天后長出的菌絲開始產孢進行2次生長，在室溫下8～10天伊氏線蟲菌就徹底消解線蟲(曾顯雄， 2003； Liouetal.， 1999； 杜婷， 2013； 杜婷等， 2014； 王婷婷， 2014b)。

不同伊氏線蟲菌菌株對松材線蟲的侵染過程相同，但侵染能力卻有較大差別,其中CBS115803對松材線蟲的侵染力最高,CBS115803菌株孢子仍著生于產抱梗上時，接種線蟲24 h后，孢子黏附率達100%，4天后線蟲死亡率達100%，ATCC74485與CNU120806 對松材線蟲的侵染力較低(Wangetal.， 2008； 2009a； 杜婷， 2013； 杜婷等， 2014； 黃海華等， 2016)。分生孢子脫離產孢梗后，其對線蟲的黏附率和死亡率都顯著降低，所以其致病力也會相應下降； 在1×106、1×107、1×108和1×109個·mL-1的4個孢子濃度對線蟲的作用中，孢子對線蟲侵染能力隨著孢子濃度的降低而降低(杜婷， 2013； 杜婷等， 2014)。

3.3 松材線蟲與真菌之間的相互關系

伊氏線蟲菌可以產生吸引松材線蟲的揮發性和非揮發性化合物。揮發性吸引物質由活菌絲體產生，可以擴散到周圍空氣中以將遠端分離的線蟲吸引到真菌附近，再將其吸引黏附到分生孢子上(Wangetal.， 2009b； 2010a)。通過紫外線照射后，真菌死亡，無法產生吸引線蟲的物質，所以不再吸引線蟲(Wangetal.， 2010a)。伊氏線蟲菌的活菌絲體不僅對瓊脂平板上的松材線蟲有吸引力，還對接種線蟲15天和30天的松苗里的松材線蟲以及發病枯萎松樹中的松材線蟲都有強烈的吸引作用。在松材線蟲病初期，松樹體內松材線蟲數量較少，線蟲主要受松樹組織釋放的物質吸引； 隨著松材線蟲數量的增加，松材線蟲病進入第2階段，松樹吸引松材線蟲的物質產量減少，此時伊氏線蟲菌對松材線蟲的吸引力相對增加； 最后，松樹衰弱逐漸死亡，松樹對松材線蟲的吸引力減弱或消失，而伊氏線蟲菌表現出對松材線蟲具有較高吸引力(Wangetal.， 2009b)。伊氏線蟲菌能夠在松樹分泌的樹脂和其他化學物質中存活，并用月形孢子繁殖侵染其他在寄主樹中移動的松材線蟲(Wangetal.， 2011a)。

從伊氏線蟲菌活菌絲體產生的揮發性物質中，鑒定了3種吸引松材線蟲的物質，分別為α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦，比例約為28∶12∶1，使用α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦吸引松材線蟲的最小劑量分別為50、12、1.6 ng(Linetal.， 2013)。其中化合物α-蒎烯和β-蒎烯也是松褐天牛的幼蟲和成蟲及其寄主馬尾松和垂死黑松的揮發性有機物組分(Takeuchietal.， 2006； Fanetal.， 2007； Zhaoetal.， 2007； Aikawaetal.， 2008)。α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦對松材線蟲有較強的吸引力，樟腦在被松材線蟲感染的松樹生物測定中顯示出對松材線蟲的吸引力顯著增加(Yunetal.， 2012)。因此Lin等(2013)認為伊氏線蟲菌采取了宿主欺騙，其通過產生模擬松材線蟲宿主松樹的香味(α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦)而引誘松材線蟲吸取營養，然而，只有這3種成分已被確定，可能還有一些活性揮發物被忽略，同時還需要進一步確定伊氏線蟲菌非揮發性化合物成分。

松材線蟲為伊氏線蟲菌提供營養，同時松材線蟲也能以伊氏線蟲菌的菌絲體為食。線蟲代謝物和勻漿物都能刺激和促進伊氏線蟲菌生長，但線蟲代謝物的影響略高于線蟲勻漿物，線蟲揮發物對伊氏線蟲菌的生長沒有影響，但是松材線蟲能夠增強伊氏線蟲菌的孢子形成(Wangetal.， 2010b； Wangetal.， 2015a)。

3.4 對其他寄主的研究

伊氏線蟲菌作為一種線蟲內寄生真菌，不僅能夠通過侵染殺死松材線蟲，還可以侵染多種其他線蟲(表3)。不同菌株對不同線蟲表現出的侵染性不同，與松材線蟲相比，CNU 120806對全齒復活線蟲(P.redivivusl)侵染性更高(Wangetal.， 2008)。NKF13222對于松材線蟲的的侵染性最高，其次為擬松材線蟲，最低的是水稻干尖線蟲(Aphelenchoidesbessyi)(Kubátováetal.， 2000； 王婷婷等， 2014a)。伊氏線蟲菌感染性依賴于線蟲種類而變化，但目前這種機制尚不清楚，但是這種寄生線蟲-寄主關系可能為除松材線蟲以外的其他種類的線蟲，特別是一些重要的植物寄生線蟲提供了一種生物防治的途徑，此外可以用更多的線蟲物種評估伊氏線蟲菌的感染性，以發現更多可能的宿主并擴大應用。

表3 伊氏線蟲菌對不同線蟲的黏附和侵染①Tab.3 Differential response of nematodes to the attachment and infection by lunate conidia of E. vermicola

①+: 黏附或侵染Attachment or infection -: 不黏附或侵染No attachment or infection.

4 培養條件對伊氏線蟲菌生長、產孢和孢子侵染活力的影響

4.1 營養條件

營養和環境因素決定了伊氏線蟲菌的生長和孢子形成，從而影響其對宿主線蟲的感染力。營養對不同伊氏線蟲菌菌株生長和產孢的影響是不同的(表2)(Liouetal.， 1999； Wangetal.， 2008； Wangetal.， 2014a)。伊氏線蟲菌在營養豐富的固體培養基中培養，其孢子表現出對線蟲有較強的侵染力(杜婷等， 2015)。在營養豐富的PDA培養基中菌株NK13222生長速度較快，8天后菌落直徑為3.2～3.5 cm，菌絲濃密，外圍新鮮的菌絲呈白色，孢子量多，但大部分為桿狀孢子，月形孢子非常少。菌株NK13222在營養較弱的CMA培養基中生長速度與PDA培養基無明顯差異，但其菌絲稀少，孢子較多，但桿狀孢子居多。菌株NK13222在營養較弱的WA培養基中生長速度非常緩慢，8天后的菌落直徑約為2.3 cm，菌絲稀少呈白色絮狀，孢子量較少，但大部分為月形孢子，桿狀孢子較少。所以在菌株擴繁時可選擇營養豐富的PDA培養基，而在需要獲得較多月形黏性孢子時可選擇營養條件最弱的WA培養基(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。在另一個試驗中也顯示了同樣的結果，伊氏線蟲菌在PDA培養基(高碳源)上生長和產孢能力最強，但是月形孢子的比例和線蟲侵染力最低，而WA培養基(無營養)上月形孢子比例和線蟲侵染力最高(王海華等， 2016)。

4.2 碳濃度、碳氮比和碳氮源

碳濃度、碳氮比和碳氮源的不同對伊氏線蟲菌菌絲生長和產孢有不同的影響。碳濃度為12 g·L-1、碳氮比為40∶1時，孢子產量最高； 碳濃度為12 g·L-1，碳氮比為5∶1時，菌絲生物量最高，在培養第7天時菌絲體達到最大值，第11天時孢子產量最高(杜婷等， 2015)。補充甘氨酸和L-亮氨酸作為氮源對菌落的生長速率有顯著影響，使菌落干質量比硝酸銨和對照增加5倍。硝酸銨和L-亮氨酸作為氮源可以促進孢子形成，產生超過6×106CFU·g-1，但以甘氨酸作為氮源提高了月形孢子的比例。同時，氮源的補充對松材線蟲黏附率和死亡率有顯著影響(Wangetal.， 2011b)。菌株NKF13222的產孢量與不同的碳氮源和碳氮比之間有很大關系，碳氮源為SA(C：蔗糖；N：硫酸銨)、SP(C：蔗糖；N：蛋白酪)和GIY(C：葡萄糖；N：酵母提取物)組合的孢子量明顯低于GaA(C：半乳糖；N：硫酸銨)和GaP(C：半乳糖；N：蛋白酪)的組合中孢子量； 在PDB(無氮源)培養基中培養時，其產孢量均低于以上處理； 在GaA和SA組合中，C∶N=10∶1時，其產孢量最大，但當C∶N=1: 10時，則都沒有孢子產生； 在SP和GIY組合中，孢子量隨著碳氮比降低而增加； 最適合菌株NK13222產孢的液體培養為GaP組合，C∶N=100∶1，產孢量達到最多，為8.52×108個·mL-1。菌株NKF13222對糖濃度的要求不高，在低糖濃度和高糖濃度下菌株的生長差異不明顯，糖濃度為20 g·L-1時菌株的菌落直徑最大(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。

4.3 礦物鹽和過氧化氫

添加礦物鹽和過氧化氫對伊氏線蟲菌的生長、產孢和侵染活性的有明顯影響。在氯化物鹽(KCl、CaCl2、MgCl2、FeCl2和FeCl3)和鈣鹽(CaCl2、CaCO3和CaSO4)8種礦物鹽中，0.4%～0.6%的CaCl2對伊氏線蟲菌的生長速度和孢子形成起到最大的增強作用，對松材線蟲的黏附率和侵染率最高，但是CaCO3產生的月形孢子比例最高(Wangetal.， 2011c)。在過氧化氫濃度1.65 mmol·L-1、處理時間9.40 min、碳氮比=9∶1的條件下，產孢量為(2.048 ±0.053)×109個·g-1最高，是對照的12倍(Xueetal.， 2014a)。另外，將孢子與40%的甘油在真空條件下混合置于4 ℃下保存30天后，孢子仍能萌發且萌發率高于其他處理(杜婷， 2013)。

4.4 pH值

菌株在弱酸或弱堿條件下均能很好生長，但超過一定的pH值，菌落生長會受到抑制。在pH為5的PDA培養基中伊氏線蟲菌的直徑和干質量在15天后增加，而在pH為9和10的PDA培養基中伊氏線蟲菌的直徑和干質量受到抑制。在pH為6的PDA或PDB中伊氏線蟲菌的孢子形成量最高，分別為2.0×107和1.4×107CFU·mL-1。在pH為4的PDA培養基中的月形孢子比例最高，而在pH為7的PDB培養基中的月形孢子比例最高(Wangetal.， 2013)。菌株NKF13222在pH為4.5～10.5范圍內可生長，最適生長pH為4.5～8.5;當pH>9.5時，菌株生長速度明顯減緩，當pH為11.5時，菌株停止生長。在pH為6.5時，8天后菌落直徑最大，為4.33 cm(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。

4.5 溫度等其他因素

不同溫度和波動溫度培養都對伊氏線蟲菌的生長產生影響。伊氏線蟲菌最適生長溫度為25～26℃，在此溫度下，其生長速度最快，分生孢子萌發率最高。在10和15 ℃下，菌絲生長8天后菌落直徑小于1 cm，生長速度十分緩慢； 在20和25 ℃下菌絲加速生長，在25℃下菌絲生長8天后菌落直徑達4.4 cm，生長速度最快； 25～26 ℃之后，菌絲生長速度隨著溫度升高而降低，在30 ℃和20 ℃下菌株生長速度無明顯差異，但當溫度升高到35 ℃后，菌株不生長(Kubátováetal.， 2000； Xueetal.， 2013a； 王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a； Wangetal.， 2015b)。干燥條件使伊氏線蟲菌孢子含水量降低，而影響其萌發，在干燥條件下其孢子萌發能力與保存的時間呈負相關，孢子在干燥條件下保存48 h后就會完全失活，但如果孢子含水量保持在40%以上，其萌發率就能維持在80%左右(杜婷， 2013)。菌株NKF13222在全黑暗條件下菌株長勢良好，菌絲旺盛，而光暗交替或全光照條件都不利于菌株的生長，菌絲生長速度降低，菌株長勢較弱，全光照條件時菌株生長最慢(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。

5 伊氏線蟲菌的抗性

眾所周知，諸如風、雨、紫外線輻射，高溫和干旱等環境壓力是影響生物防治劑在田間或野外建立和生存的障礙。添加甘氨酸或黃芩(Scutellariabaicalensis)、魚腥草(Houttuyniacordata)和鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)提取物可以極大地提高伊氏線蟲菌對熱、紫外線輻射和干旱脅迫的抗性(Wangetal.， 2011b； Xueetal.， 2013b)。它們之所以有促進效應，一個可能的原因是熱休克蛋白表達和海藻糖合成的上調，另一個可能與細胞內糖醇和糖含量的適應有關(Xueetal.， 2013a)。在較低溫度下伊氏線蟲菌表現出更好的生長，對干燥、紫外線和過氧化氫脅迫的耐受性更強，并且過氧化氫酶表達增加。但是，低溫培養表現出比高溫培養更弱的熱應激耐受性和更低的超氧化物歧化酶表達。在20～30 ℃溫度波動下培養的伊氏線蟲菌表現出最佳性能。因此，對于實際生產應用而言，這種微弱的波動、溫和的溫度對于伊氏線蟲菌的產量和脅迫耐受性會更好(Wangetal.， 2015b)。

6 伊氏線蟲菌分子生物學研究

近幾年來，對于伊氏線蟲菌分子生物學層面的研究增多。伊氏線蟲菌基因組(34.2 Mbp)已被完整測序，其中擴展的轉運蛋白家族和endo-beta-glucanase意味著伊氏線蟲菌在擾亂線蟲代謝和寄生行為方面具有很大的遺傳潛力(王瑞珍， 2017； Wangetal.， 2018a)。菌株CBS 115803的完整線粒體基因組通過PacBio RS II測序技術完成測序，環狀分子長度為47 282 bp，GC含量為24.85%。注釋的基因包括14個保守的蛋白質編碼基因，1個大的和1個小的rRNA亞基(rnl和rns)以及27個tRNA，通過對線粒體基因組序列的系統發育分析，發現伊氏線蟲菌與Sporothrix屬有較近的親緣關系(王瑞珍， 2017； Wangetal.， 2017a)。同時在菌株CBS100821、ATCC74485、CBS115803和CUN120806細胞內發現存在內生細菌，該內生細菌隸屬于γ-變形菌門(Gammaproteobacteria)，球狀，細胞直徑在50 nm～2 μm之間，細胞壁厚度、細胞大小和繁殖程度在細菌生長的前期和后期不同。該細菌與伊氏線蟲菌之間存在緊密的共生關系，目前還不可人工培養，對于該細菌的研究將有助于揭示內生細菌在伊氏線蟲菌宿主進化和生態學作用，該研究還需要進一步進行(王瑞珍， 2017)。

伊氏線蟲菌被報道時間不長，所以對其分子層面的侵染機制還在不斷探索。目前，一個對松材線蟲具有強毒力的絲氨酸蛋白酶基因Evsp(GenBank登錄號KP698922)從菌株NKF13222被克隆出來。Evspcontains的全長cDNA含有一個165 602 bp的ORF，編碼一個含有551個氨基酸的蛋白質?；蚪MEvsp包括由內含子(20 702 bp)分開的2個外顯子(39 602 bp和126 002 bp)，真菌基因組中只有一個Evspgene拷貝。其與枯草溶菌素絲氨酸蛋白酶中的催化結構域高度同源。通過基于絲氨酸蛋白酶氨基酸序列的系統發育分析發現，伊氏線蟲菌與內寄生真菌、昆蟲病原真菌、產毒真菌及機會真菌有著較近的親緣。絲氨酸蛋白酶rEvsp能降解并破壞松材線蟲體壁，其可能在伊氏線蟲菌對松材線蟲侵染過程中起到重要作用。將約3.6 kb的線性融合片段轉化進伊氏線蟲菌得到基因缺失突變體菌株ES84，其和野生型菌株NKF13222對松材線蟲的黏附率和侵染率差異不顯著，可能是伊氏線蟲菌的絲氨酸蛋白酶rEvsp在基因功能上存在冗余性(張龍， 2015； Wangetal.， 2015c)。

在野外試驗中，僅通過顯微鏡觀察檢查伊氏線蟲菌是非常不方便和低效的，并且無法將月形孢子和其他真菌的菌絲體區分開來。最近，將FTA-DNA提取和PCR擴增結合起來，通過存在176 bp特異性片段從環境中檢測伊氏線蟲菌是一種簡單易行的方法?；谝潦暇€蟲菌的幾丁質酶基因設計的引物(上游5′-GTGCCTCTACCAAG ACTCGC-3′;下游5′-CGCCAAATGTCAAGATCCGC-3′)表現出優異的特異性，高靈敏度和效率，該方法為后續的研究提供了重要的技術支持。理論上，只要樣品含有的伊氏線蟲菌菌絲體或分生孢子，它們就可以被有效地檢測到(魏柯， 2014； Weietal.， 2014)。

7 在松材線蟲病防治中應用

7.1 制劑劑型

如運用伊氏線蟲菌進行林間防治松材線蟲病，就要將其研制成為一種適應野外生存條件，具有長保質期的制劑劑型。采用4%脫脂牛奶、0.2%腐植酸、5%山梨醇、0.05% CaCl2、延展劑和抗生素配方制成的孢制劑，在不利的環境條件下能對真菌孢子起到最有效的保護作用，并能提高該種真菌孢子應對多種環境脅迫時的抵抗力和對線蟲的致死率(Wangetal.， 2012)。將伊氏線蟲菌加入2%海藻酸鈉和5%粘土制成的伊氏線蟲菌藻酸鹽 - 黏土制劑，是一種非真空包裝的制劑，在4℃中保存其孢子活力最強，而且能有效延長伊氏線蟲菌的保質期。添加了15%甘油、0.5%酵母提取物和0.5%草藥提取物制備的3種分生孢子制劑的保質期也顯著延長(Xueetal.， 2014b)。將10%高嶺土、0.1%司盤80、1%阿拉伯糖、5%山梨糖醇和5%PEG8000摻入海藻酸鈣凝膠膠囊中在-70 ℃保存1個月，伊氏線蟲菌分生孢子還保持較高的生存力(Wangetal.， 2016)。用珍珠巖作為真菌載體保存于液氮中，2天和1年后其均能保持原來的生長，且其微生物形態未被改變(Homolkaetal.， 2007)。

7.2 使用方法

伊氏線蟲菌具有很高的開發為一種防治松材線蟲病生物農藥的潛力。在溫室和野外采用樹干注射、樹冠噴灑和傷口接種等不同方法施用含有該真菌的生防菌，均能降低松材線蟲對松樹的侵染，還在用該菌處理過的松樹中發現該菌菌絲、孢子和被月形孢子侵染的松材線蟲(Wangetal.， 2011a； Wangetal.， 2011b)。

樹干注射： 溫室試驗和2年的林間試驗發現接種的伊氏線蟲菌可以在松樹內生長繁殖并不斷侵染松樹內的松材線蟲，可在4～5天內殺死幾乎所有測試的松材線蟲(Sungetal.， 2010)。用300 μL和40 mL 伊氏線蟲菌分生孢子懸浮液(109個·mL-1)注射接種松樹幼苗和大樹，所有處理過的松樹都是健康的。此外，在木片上未觀察到由該真菌引起的壞死或變色(Wangetal.， 2011d)。

樹冠噴灑： 伊氏線蟲菌噴灑處理顯著提高了被松材線蟲感染的松樹幼苗的存活率。將3×108和3×106個·mL-1的伊氏線蟲菌分生孢子懸浮液噴灑在將要死亡的赤松(Pinusdensiflora)上，2個月后線蟲密度分別下降約79%和47%。同時，在接種松材線蟲前1個月將真菌噴灑到4年生松樹幼苗上時，幼苗的存活指數達到0.67，而沒有真菌噴灑的對照幼苗僅為0.067，并且在經過處理的木材部分中觀察到伊氏線蟲菌感染的線蟲和菌絲(Wangetal.， 2011a)。在另一試驗中，噴灑了107cfu·mL-1伊氏線蟲菌的植物比未處理的松樹幼苗的存活率高73.0%。在線蟲感染前14天用107cfu·mL-1伊氏線蟲菌處理松樹幼苗，其存活率提高了90.0%。從噴灑了伊氏線蟲菌的死松幼苗中分離的松木線蟲的數量比對照中的松材線蟲數量少76%。此外，在死亡或枯萎的松樹幼苗中可以檢測到被伊氏線蟲菌感染的線蟲和菌絲(Wangetal.， 2017b)。

傷口接種： 將被月形孢子黏附的松材線蟲(40%)懸浮液接種至赤松松苗上并置于溫室培養，鏡檢發現幼苗枝條木段組織中有被染成藍色的線蟲和菌絲，在木段切片中還發現了正常線蟲，有的線蟲體表還能看到月形孢子和菌絲，偶爾能看到菌絲和月形孢子分散在木段切片中(Zhaoetal.， 2007)。在韓國晉州經過長達6年的林間試驗中，松樹在人工接種松材線蟲(PWN)感染前用伊氏線蟲菌處理，30%以上的樹存活6年，未經過伊氏線蟲菌處理的樹全部死亡。同時，在6年后可以在處理過的松樹內部檢測到伊氏線蟲菌的存在(Wangetal.， 2018b)。

8 展望

松材線蟲病是一種能造成松林成片毀滅的流行性病害，嚴重破壞了疫區生態系統，造成了巨大的經濟損失，控制松材線蟲病的傳染和制定防治策略極為重要。伊氏線蟲菌作為一種松材線蟲的內寄生真菌，從自然界中分離，無毒，寄主范圍較小，不影響其他生物的生存，而且其能在松樹中存活，并用月形孢子繁殖寄生其他移動的松材線蟲，具有作為一種真菌劑制防治松材線蟲病的潛力(Wangetal.， 2011d)。除真菌伊氏線蟲菌外，松材線蟲的生防微生物有食線蟲真菌、細菌和放線菌等。目前已經有野外試驗證明對松材線蟲病防治有效的生防微生物除了伊氏線蟲菌之外還有Smal-007(韓正敏等， 2013； 南京林業大學， 2014)。Smal-007是從美國松材線蟲體表分離篩選到的一株嗜麥芽窄食單菌(Stenotrophomnasmaltophilia)，該菌致病力弱、定殖和替代能力強、對環境安全無毒(曾腓力等， 2012； 賁愛玲等， 2013)。在福建三明市等地小面積的林間防治試驗取得良好結果，但在噴灑該細菌后要保持48 h無雨，因為降雨會影響細菌的定殖(姚伍等， 2018)。Smal-007只能降低松材線蟲的致病力，并不能直接殺死線蟲，而伊氏線蟲菌是內寄生于松材線蟲體內，可殺死松材線蟲，2種生防菌的防治機制不同。

本實驗室對真菌伊氏線蟲菌野外防治松材線蟲病做了初步研究。設置了A、B、C和D4組試驗，研究了利用伊氏線蟲菌孢子懸浮液來預防松材線蟲病的可行性。3組試驗分別為先噴灑孢子懸浮液和1周后接入松材線蟲(A處理)，噴灑孢子懸浮液的同時接入松材線蟲(B處理)，先接入松材線蟲和1周后噴灑孢子懸浮液(C處理)，只接線蟲不噴孢子懸浮液(D處理，對照)；線蟲接入量為每棵樹1 000頭，孢子懸浮液濃度為1×108個·mL-1，接入量為每棵10 mL。試驗結果表明A組在接種完線蟲的第2個月開始出現枯萎癥狀，比其他處理表現出癥狀要更緩、更少。A、B和C不同處理對線蟲的侵染活力上存在差異，D組大部分松樹遭到了嚴重的為害，表現出松針變黃、大部分枯萎和死亡。初步證明運用伊氏線蟲菌孢子懸浮液來預防松材線蟲病具有一定的可行性，但是最佳預防時間等其他的條件還需要進一步的試驗研究。除上述試驗外，本實驗室還對松褐天牛與真菌伊氏線蟲菌的相互作用關系進行了初步試驗。設置了天牛取食的松樹枝噴灑孢子懸浮液和天牛浸泡孢子懸浮液再取食松樹枝2個初步試驗，研究伊氏線蟲菌是否可以通過松褐天牛取食松枝的傷口進入松樹內。結果表明這2個處理間差異不顯著，但隨著時間的延長，直接噴灑在樹枝上的孢子侵染的能力相對要強。

綜上所述，噴灑伊氏線蟲菌孢子懸浮液能在一定程度上保護松樹，盡管效果沒有化學藥劑快，但該菌是一種非常有潛力的可用于防治松材線蟲的天敵。目前對伊氏線蟲菌的生物防治研究還在初期階段，林間的推廣應用要考慮壞境和氣候等多方面的因素的綜合影響。盡管在試驗中伊氏線蟲菌有明顯的致死松材線蟲的效果，但松材線蟲病是松樹、病原松材線蟲、媒介松褐天牛、真菌等微生物、各種環境和氣候條件之間復雜的相互作用造成的，伊氏線蟲菌侵染松材線蟲的效力會受到這種復雜性的影響。因此還需要大量的研究來進一步推進該菌的應用，下一步應該增加林間防治試驗的研究，探明防治的最佳條件，如防治時間，防治次數和劑量等，形成一套完整的防治方案。同時，目前關于伊氏線蟲菌的研究主要集中在其與松材線蟲之間。松褐天牛作為松材線蟲的攜帶者，是松材線蟲病的傳播媒介，其與伊氏線蟲菌之間的關系也值得深入研究，可為松褐天牛與伊氏線蟲菌相結合防治松材線蟲病提供基礎。