松材線蟲生防真菌伊氏線蟲菌研究進(jìn)展*

茅裕婷 馬 濤 藍(lán)來(lái)嬌 溫秀軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510642)

松材線蟲病(Bursaphelenchusxylophilus)又稱松樹萎蔫病，是一種能造成松林快速枯萎死亡、對(duì)森林資源造成嚴(yán)重危害、給國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)極大損失的全球檢疫性和毀滅性流行病害(潘宏陽(yáng)等， 2009； Vicenteetal., 2012)。松材線蟲病致病因子為松材線蟲，并通過(guò)人為因素和媒介天牛等進(jìn)行傳播擴(kuò)散(Zhaoetal.， 2008； 張星耀等， 2011)。目前，主要從其病原松材線蟲和傳播媒介松褐天牛(M.alternatus)2個(gè)方面，實(shí)行預(yù)防為主，結(jié)合物理、化學(xué)和生物防治對(duì)松材線蟲病進(jìn)行綜合治理，但都沒(méi)能控制和拔除疫區(qū)(Leeetal.， 2003； 劉剛， 2006； 仇輝康， 2015)。

目前生防微生物和植物性殺線蟲物質(zhì)被用于生物防治松材線蟲，并得到了廣泛的研究(Olibeiraetal.， 2004； 袁永平等， 2010； 姚伍等， 2018)。伊氏線蟲菌(Esteyavermicola)又稱伊氏殺線真菌和蠕蟲埃斯特菌，是第一個(gè)被記錄的內(nèi)寄生松材線蟲的真菌，對(duì)松材線蟲表現(xiàn)出高侵染性和寄生率，具有作為抗松材線蟲病的生物防治劑的前景和潛力，在美國(guó)和韓國(guó)均獲得專利(Liouetal.， 1999； Tzeanetal.， 2001； Fangetal.， 2010； 王婷婷等， 2014a； 王瑞珍， 2017)。目前，應(yīng)用伊氏線蟲菌進(jìn)行松材線蟲病防治引起越來(lái)越多的關(guān)注，本文綜述了伊氏線蟲菌的最新研究進(jìn)展，并簡(jiǎn)要討論其在未來(lái)松材線蟲病生物防治中的應(yīng)用潛力以及研究方向，以期為國(guó)內(nèi)廣大生物防治工作者提供參考，推動(dòng)該菌在生物防治松材線蟲病上的推廣應(yīng)用。

1 發(fā)現(xiàn)

Liou等(1999)在被松材線蟲侵染的黑松(Pinusthunbergii)心材木片上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)寄生于松材線蟲的新屬新種真菌，并將其命名為Esteyavermicola，這是首次對(duì)該菌的報(bào)道，菌株號(hào)為ATCC74485，為模式種。2000年，在捷克的正毛束小蠹(Scolytusintricatus)及其所在的橡樹(Querqus)坑道中第2次分離出了伊氏線蟲菌，菌株號(hào)為CBS115803(Kubátováetal.， 2000)。2006年，在韓國(guó)清道郡松林土壤里被侵染的腐生線蟲中第3次分離得到伊氏線蟲菌，菌株CNU120806(Wangetal.， 2008)。2014年，在天津從巴西進(jìn)境木質(zhì)包裝材料截獲的魯爾夫傘滑刃線蟲(B.rainulgi)中分離出1株內(nèi)寄生真菌菌株NKF13222，經(jīng)過(guò)鑒定確定其為伊氏線蟲菌的一個(gè)新菌株(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。此外，伊氏線蟲菌還有2個(gè)菌株，由皇家荷蘭生物科技研究所培養(yǎng)物保藏中心(CBS)1982年分離于日本的菌株CBS156.82和1998年于意大利的菌株CBS100821，這2株菌株在伊氏線蟲菌被命名和詳細(xì)描述之前一直被命名為其他名字，因此幾乎不為人所知(Wangetal.， 2009a)。目前，已發(fā)現(xiàn)的6個(gè)菌株(表1)分別來(lái)自于東亞、歐洲和南美洲，該真菌作為松材線蟲的內(nèi)寄生性天敵，可能遍布在全球范圍內(nèi)。

從形態(tài)學(xué)特征和侵染模式對(duì)幾個(gè)菌株進(jìn)行區(qū)分：CNU120806與ATCC74485、 CBS115803相似，NKF13222與ATCC74485相似，但NKF1322與CBS115803、CNU120806在孢子形成和孢子萌發(fā)方式上有差異(Wangetal.， 2009a； 王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)?；?個(gè)基因序列β-tubulin和EF1-α構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示ATCC74485和NKF13222有更近的親緣關(guān)系(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。通過(guò)28S rRNA基因序列分析，CBS115803和CNU120806有100%的同源性，在親緣關(guān)系上最近(Wangetal.， 2009a)。

2 形態(tài)特征與生物學(xué)特性

伊氏線蟲菌是真菌界(Fungi)子囊菌門(Ascomycota)子囊菌綱(Ascomycetes)肉座菌目(Hypocreales) Ophiostomataceae 科Esteya屬唯一的種。各菌株形態(tài)特征比較見(jiàn)表2。

表1 伊氏線蟲菌的6個(gè)分離株的詳細(xì)信息Tab.1 Details on the six E. vermicola isolates available to date

表2 4個(gè)E. vermicola菌株的形態(tài)特征比較Tab.2 Comparison of morphological characteristics of 4 E. vermicola strains

3 侵染機(jī)制

3.1 孢子萌發(fā)方式

不同菌株伊氏線蟲菌的孢子萌發(fā)方式不同(表2)。伊氏線蟲菌在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，月形孢子一般從孢子凹面中間處萌發(fā)并產(chǎn)生1個(gè)或多個(gè)芽管，接著芽管分枝形成營(yíng)養(yǎng)菌絲，但有時(shí)月形包子也會(huì)在孢子凸面中間處萌發(fā)。桿狀孢子一般從孢子1/3～1/2處萌發(fā)并可產(chǎn)生1到多個(gè)芽管，但有時(shí)桿狀孢子也會(huì)從孢子端部萌發(fā)，其與鉤絲孢屬真菌產(chǎn)生的附著胞相似。伊氏線蟲菌在PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生圓形、卵形或長(zhǎng)橢圓形等不同形態(tài)的芽生孢子。芽生孢子出芽方式多變，可以再萌發(fā)產(chǎn)生芽孢，或者發(fā)芽后形成細(xì)長(zhǎng)的柄，在柄上產(chǎn)生黏性孢子； 也可以萌發(fā)產(chǎn)生其他芽孢后，通過(guò)分化產(chǎn)生瓶梗狀產(chǎn)孢細(xì)胞和黏性孢子； 還可以1個(gè)芽胞2邊發(fā)芽形成2種產(chǎn)孢細(xì)胞并著生不同的分生孢子。在WA培養(yǎng)基上接種液體培養(yǎng)產(chǎn)生的芽生孢子會(huì)直接在芽孢上產(chǎn)生可黏附線蟲的黏性孢子或者繼續(xù)出芽聚集形成芽孢堆； 有些芽生孢子會(huì)發(fā)芽萌發(fā)延伸為菌絲并著生著瓶梗，于瓶梗上產(chǎn)生黏性孢子(曾顯雄， 2003)。目前，可通過(guò)中性紅和亞甲藍(lán)的混合物對(duì)孢子進(jìn)行染色來(lái)快速評(píng)估伊氏線蟲菌分生孢子的活性，染色后活細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞壁呈藍(lán)色染色，而死細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色(Wangetal.， 2014b)。

3.2 孢子黏附侵染機(jī)制

伊氏線蟲菌侵染松材線蟲的過(guò)程和機(jī)制： 線蟲在菌落中游走時(shí)碰到月形孢子凹面，月形孢子立即黏附于線蟲體表，并從產(chǎn)孢梗上脫落，隨著線蟲移動(dòng)。月形孢子以凹面隨機(jī)黏附到線蟲體表任何部位，但分布最多的是線蟲頭部，然后是尾端，最少的是線蟲身體中部。月形孢子黏附線蟲體表16～24 h后，從孢子狀構(gòu)造處開(kāi)始分化產(chǎn)生侵入釘，穿透黏著層壓迫線蟲體壁，接著侵入釘穿透線蟲體壁的角質(zhì)層及肌肉層，逐漸膨大形成菌絲體釋放到線蟲體內(nèi)。之后，菌絲體吸取線蟲細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，形成同化菌絲，并產(chǎn)生分支，在線蟲體內(nèi)蔓延生長(zhǎng)。隨著菌絲的生長(zhǎng)，線蟲移動(dòng)減慢，活性降低，黏著48 h后，菌絲擠破線蟲體壁向外長(zhǎng)出，3～4天后的菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)、分枝并蔓延，6天后長(zhǎng)出的菌絲開(kāi)始產(chǎn)孢進(jìn)行2次生長(zhǎng)，在室溫下8～10天伊氏線蟲菌就徹底消解線蟲(曾顯雄， 2003； Liouetal.， 1999； 杜婷， 2013； 杜婷等， 2014； 王婷婷， 2014b)。

不同伊氏線蟲菌菌株對(duì)松材線蟲的侵染過(guò)程相同，但侵染能力卻有較大差別,其中CBS115803對(duì)松材線蟲的侵染力最高,CBS115803菌株孢子仍著生于產(chǎn)抱梗上時(shí)，接種線蟲24 h后，孢子黏附率達(dá)100%，4天后線蟲死亡率達(dá)100%，ATCC74485與CNU120806 對(duì)松材線蟲的侵染力較低(Wangetal.， 2008； 2009a； 杜婷， 2013； 杜婷等， 2014； 黃海華等， 2016)。分生孢子脫離產(chǎn)孢梗后，其對(duì)線蟲的黏附率和死亡率都顯著降低，所以其致病力也會(huì)相應(yīng)下降； 在1×106、1×107、1×108和1×109個(gè)·mL-1的4個(gè)孢子濃度對(duì)線蟲的作用中，孢子對(duì)線蟲侵染能力隨著孢子濃度的降低而降低(杜婷， 2013； 杜婷等， 2014)。

3.3 松材線蟲與真菌之間的相互關(guān)系

伊氏線蟲菌可以產(chǎn)生吸引松材線蟲的揮發(fā)性和非揮發(fā)性化合物。揮發(fā)性吸引物質(zhì)由活菌絲體產(chǎn)生，可以擴(kuò)散到周圍空氣中以將遠(yuǎn)端分離的線蟲吸引到真菌附近，再將其吸引黏附到分生孢子上(Wangetal.， 2009b； 2010a)。通過(guò)紫外線照射后，真菌死亡，無(wú)法產(chǎn)生吸引線蟲的物質(zhì)，所以不再吸引線蟲(Wangetal.， 2010a)。伊氏線蟲菌的活菌絲體不僅對(duì)瓊脂平板上的松材線蟲有吸引力，還對(duì)接種線蟲15天和30天的松苗里的松材線蟲以及發(fā)病枯萎松樹中的松材線蟲都有強(qiáng)烈的吸引作用。在松材線蟲病初期，松樹體內(nèi)松材線蟲數(shù)量較少，線蟲主要受松樹組織釋放的物質(zhì)吸引； 隨著松材線蟲數(shù)量的增加，松材線蟲病進(jìn)入第2階段，松樹吸引松材線蟲的物質(zhì)產(chǎn)量減少，此時(shí)伊氏線蟲菌對(duì)松材線蟲的吸引力相對(duì)增加； 最后，松樹衰弱逐漸死亡，松樹對(duì)松材線蟲的吸引力減弱或消失，而伊氏線蟲菌表現(xiàn)出對(duì)松材線蟲具有較高吸引力(Wangetal.， 2009b)。伊氏線蟲菌能夠在松樹分泌的樹脂和其他化學(xué)物質(zhì)中存活，并用月形孢子繁殖侵染其他在寄主樹中移動(dòng)的松材線蟲(Wangetal.， 2011a)。

從伊氏線蟲菌活菌絲體產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中，鑒定了3種吸引松材線蟲的物質(zhì)，分別為α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦，比例約為28∶12∶1，使用α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦吸引松材線蟲的最小劑量分別為50、12、1.6 ng(Linetal.， 2013)。其中化合物α-蒎烯和β-蒎烯也是松褐天牛的幼蟲和成蟲及其寄主馬尾松和垂死黑松的揮發(fā)性有機(jī)物組分(Takeuchietal.， 2006； Fanetal.， 2007； Zhaoetal.， 2007； Aikawaetal.， 2008)。α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦對(duì)松材線蟲有較強(qiáng)的吸引力，樟腦在被松材線蟲感染的松樹生物測(cè)定中顯示出對(duì)松材線蟲的吸引力顯著增加(Yunetal.， 2012)。因此Lin等(2013)認(rèn)為伊氏線蟲菌采取了宿主欺騙，其通過(guò)產(chǎn)生模擬松材線蟲宿主松樹的香味(α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦)而引誘松材線蟲吸取營(yíng)養(yǎng)，然而，只有這3種成分已被確定，可能還有一些活性揮發(fā)物被忽略，同時(shí)還需要進(jìn)一步確定伊氏線蟲菌非揮發(fā)性化合物成分。

松材線蟲為伊氏線蟲菌提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)松材線蟲也能以伊氏線蟲菌的菌絲體為食。線蟲代謝物和勻漿物都能刺激和促進(jìn)伊氏線蟲菌生長(zhǎng)，但線蟲代謝物的影響略高于線蟲勻漿物，線蟲揮發(fā)物對(duì)伊氏線蟲菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，但是松材線蟲能夠增強(qiáng)伊氏線蟲菌的孢子形成(Wangetal.， 2010b； Wangetal.， 2015a)。

3.4 對(duì)其他寄主的研究

伊氏線蟲菌作為一種線蟲內(nèi)寄生真菌，不僅能夠通過(guò)侵染殺死松材線蟲，還可以侵染多種其他線蟲(表3)。不同菌株對(duì)不同線蟲表現(xiàn)出的侵染性不同，與松材線蟲相比，CNU 120806對(duì)全齒復(fù)活線蟲(P.redivivusl)侵染性更高(Wangetal.， 2008)。NKF13222對(duì)于松材線蟲的的侵染性最高，其次為擬松材線蟲，最低的是水稻干尖線蟲(Aphelenchoidesbessyi)(Kubátováetal.， 2000； 王婷婷等， 2014a)。伊氏線蟲菌感染性依賴于線蟲種類而變化，但目前這種機(jī)制尚不清楚，但是這種寄生線蟲-寄主關(guān)系可能為除松材線蟲以外的其他種類的線蟲，特別是一些重要的植物寄生線蟲提供了一種生物防治的途徑，此外可以用更多的線蟲物種評(píng)估伊氏線蟲菌的感染性，以發(fā)現(xiàn)更多可能的宿主并擴(kuò)大應(yīng)用。

表3 伊氏線蟲菌對(duì)不同線蟲的黏附和侵染①Tab.3 Differential response of nematodes to the attachment and infection by lunate conidia of E. vermicola

①+: 黏附或侵染Attachment or infection -: 不黏附或侵染No attachment or infection.

4 培養(yǎng)條件對(duì)伊氏線蟲菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子侵染活力的影響

4.1 營(yíng)養(yǎng)條件

營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素決定了伊氏線蟲菌的生長(zhǎng)和孢子形成，從而影響其對(duì)宿主線蟲的感染力。營(yíng)養(yǎng)對(duì)不同伊氏線蟲菌菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響是不同的(表2)(Liouetal.， 1999； Wangetal.， 2008； Wangetal.， 2014a)。伊氏線蟲菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其孢子表現(xiàn)出對(duì)線蟲有較強(qiáng)的侵染力(杜婷等， 2015)。在營(yíng)養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基中菌株NK13222生長(zhǎng)速度較快，8天后菌落直徑為3.2～3.5 cm，菌絲濃密，外圍新鮮的菌絲呈白色，孢子量多，但大部分為桿狀孢子，月形孢子非常少。菌株NK13222在營(yíng)養(yǎng)較弱的CMA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度與PDA培養(yǎng)基無(wú)明顯差異，但其菌絲稀少，孢子較多，但桿狀孢子居多。菌株NK13222在營(yíng)養(yǎng)較弱的WA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度非常緩慢，8天后的菌落直徑約為2.3 cm，菌絲稀少呈白色絮狀，孢子量較少，但大部分為月形孢子，桿狀孢子較少。所以在菌株擴(kuò)繁時(shí)可選擇營(yíng)養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基，而在需要獲得較多月形黏性孢子時(shí)可選擇營(yíng)養(yǎng)條件最弱的WA培養(yǎng)基(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。在另一個(gè)試驗(yàn)中也顯示了同樣的結(jié)果，伊氏線蟲菌在PDA培養(yǎng)基(高碳源)上生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力最強(qiáng)，但是月形孢子的比例和線蟲侵染力最低，而WA培養(yǎng)基(無(wú)營(yíng)養(yǎng))上月形孢子比例和線蟲侵染力最高(王海華等， 2016)。

4.2 碳濃度、碳氮比和碳氮源

碳濃度、碳氮比和碳氮源的不同對(duì)伊氏線蟲菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢有不同的影響。碳濃度為12 g·L-1、碳氮比為40∶1時(shí)，孢子產(chǎn)量最高； 碳濃度為12 g·L-1，碳氮比為5∶1時(shí)，菌絲生物量最高，在培養(yǎng)第7天時(shí)菌絲體達(dá)到最大值，第11天時(shí)孢子產(chǎn)量最高(杜婷等， 2015)。補(bǔ)充甘氨酸和L-亮氨酸作為氮源對(duì)菌落的生長(zhǎng)速率有顯著影響，使菌落干質(zhì)量比硝酸銨和對(duì)照增加5倍。硝酸銨和L-亮氨酸作為氮源可以促進(jìn)孢子形成，產(chǎn)生超過(guò)6×106CFU·g-1，但以甘氨酸作為氮源提高了月形孢子的比例。同時(shí)，氮源的補(bǔ)充對(duì)松材線蟲黏附率和死亡率有顯著影響(Wangetal.， 2011b)。菌株NKF13222的產(chǎn)孢量與不同的碳氮源和碳氮比之間有很大關(guān)系，碳氮源為SA(C：蔗糖；N：硫酸銨)、SP(C：蔗糖；N：蛋白酪)和GIY(C：葡萄糖；N：酵母提取物)組合的孢子量明顯低于GaA(C：半乳糖；N：硫酸銨)和GaP(C：半乳糖；N：蛋白酪)的組合中孢子量； 在PDB(無(wú)氮源)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其產(chǎn)孢量均低于以上處理； 在GaA和SA組合中，C∶N=10∶1時(shí)，其產(chǎn)孢量最大，但當(dāng)C∶N=1: 10時(shí)，則都沒(méi)有孢子產(chǎn)生； 在SP和GIY組合中，孢子量隨著碳氮比降低而增加； 最適合菌株NK13222產(chǎn)孢的液體培養(yǎng)為GaP組合，C∶N=100∶1，產(chǎn)孢量達(dá)到最多，為8.52×108個(gè)·mL-1。菌株NKF13222對(duì)糖濃度的要求不高，在低糖濃度和高糖濃度下菌株的生長(zhǎng)差異不明顯，糖濃度為20 g·L-1時(shí)菌株的菌落直徑最大(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。

4.3 礦物鹽和過(guò)氧化氫

添加礦物鹽和過(guò)氧化氫對(duì)伊氏線蟲菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和侵染活性的有明顯影響。在氯化物鹽(KCl、CaCl2、MgCl2、FeCl2和FeCl3)和鈣鹽(CaCl2、CaCO3和CaSO4)8種礦物鹽中，0.4%～0.6%的CaCl2對(duì)伊氏線蟲菌的生長(zhǎng)速度和孢子形成起到最大的增強(qiáng)作用，對(duì)松材線蟲的黏附率和侵染率最高，但是CaCO3產(chǎn)生的月形孢子比例最高(Wangetal.， 2011c)。在過(guò)氧化氫濃度1.65 mmol·L-1、處理時(shí)間9.40 min、碳氮比=9∶1的條件下，產(chǎn)孢量為(2.048 ±0.053)×109個(gè)·g-1最高，是對(duì)照的12倍(Xueetal.， 2014a)。另外，將孢子與40%的甘油在真空條件下混合置于4 ℃下保存30天后，孢子仍能萌發(fā)且萌發(fā)率高于其他處理(杜婷， 2013)。

4.4 pH值

菌株在弱酸或弱堿條件下均能很好生長(zhǎng)，但超過(guò)一定的pH值，菌落生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。在pH為5的PDA培養(yǎng)基中伊氏線蟲菌的直徑和干質(zhì)量在15天后增加，而在pH為9和10的PDA培養(yǎng)基中伊氏線蟲菌的直徑和干質(zhì)量受到抑制。在pH為6的PDA或PDB中伊氏線蟲菌的孢子形成量最高，分別為2.0×107和1.4×107CFU·mL-1。在pH為4的PDA培養(yǎng)基中的月形孢子比例最高，而在pH為7的PDB培養(yǎng)基中的月形孢子比例最高(Wangetal.， 2013)。菌株NKF13222在pH為4.5～10.5范圍內(nèi)可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH為4.5～8.5;當(dāng)pH>9.5時(shí)，菌株生長(zhǎng)速度明顯減緩，當(dāng)pH為11.5時(shí)，菌株停止生長(zhǎng)。在pH為6.5時(shí)，8天后菌落直徑最大，為4.33 cm(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。

4.5 溫度等其他因素

不同溫度和波動(dòng)溫度培養(yǎng)都對(duì)伊氏線蟲菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。伊氏線蟲菌最適生長(zhǎng)溫度為25～26℃，在此溫度下，其生長(zhǎng)速度最快，分生孢子萌發(fā)率最高。在10和15 ℃下，菌絲生長(zhǎng)8天后菌落直徑小于1 cm，生長(zhǎng)速度十分緩慢； 在20和25 ℃下菌絲加速生長(zhǎng)，在25℃下菌絲生長(zhǎng)8天后菌落直徑達(dá)4.4 cm，生長(zhǎng)速度最快； 25～26 ℃之后，菌絲生長(zhǎng)速度隨著溫度升高而降低，在30 ℃和20 ℃下菌株生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異，但當(dāng)溫度升高到35 ℃后，菌株不生長(zhǎng)(Kubátováetal.， 2000； Xueetal.， 2013a； 王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a； Wangetal.， 2015b)。干燥條件使伊氏線蟲菌孢子含水量降低，而影響其萌發(fā)，在干燥條件下其孢子萌發(fā)能力與保存的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，孢子在干燥條件下保存48 h后就會(huì)完全失活，但如果孢子含水量保持在40%以上，其萌發(fā)率就能維持在80%左右(杜婷， 2013)。菌株NKF13222在全黑暗條件下菌株長(zhǎng)勢(shì)良好，菌絲旺盛，而光暗交替或全光照條件都不利于菌株的生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速度降低，菌株長(zhǎng)勢(shì)較弱，全光照條件時(shí)菌株生長(zhǎng)最慢(王婷婷， 2014b； Wangetal.， 2014a)。

5 伊氏線蟲菌的抗性

眾所周知，諸如風(fēng)、雨、紫外線輻射，高溫和干旱等環(huán)境壓力是影響生物防治劑在田間或野外建立和生存的障礙。添加甘氨酸或黃芩(Scutellariabaicalensis)、魚腥草(Houttuyniacordata)和鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)提取物可以極大地提高伊氏線蟲菌對(duì)熱、紫外線輻射和干旱脅迫的抗性(Wangetal.， 2011b； Xueetal.， 2013b)。它們之所以有促進(jìn)效應(yīng)，一個(gè)可能的原因是熱休克蛋白表達(dá)和海藻糖合成的上調(diào)，另一個(gè)可能與細(xì)胞內(nèi)糖醇和糖含量的適應(yīng)有關(guān)(Xueetal.， 2013a)。在較低溫度下伊氏線蟲菌表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)，對(duì)干燥、紫外線和過(guò)氧化氫脅迫的耐受性更強(qiáng)，并且過(guò)氧化氫酶表達(dá)增加。但是，低溫培養(yǎng)表現(xiàn)出比高溫培養(yǎng)更弱的熱應(yīng)激耐受性和更低的超氧化物歧化酶表達(dá)。在20～30 ℃溫度波動(dòng)下培養(yǎng)的伊氏線蟲菌表現(xiàn)出最佳性能。因此，對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用而言，這種微弱的波動(dòng)、溫和的溫度對(duì)于伊氏線蟲菌的產(chǎn)量和脅迫耐受性會(huì)更好(Wangetal.， 2015b)。

6 伊氏線蟲菌分子生物學(xué)研究

近幾年來(lái)，對(duì)于伊氏線蟲菌分子生物學(xué)層面的研究增多。伊氏線蟲菌基因組(34.2 Mbp)已被完整測(cè)序，其中擴(kuò)展的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族和endo-beta-glucanase意味著伊氏線蟲菌在擾亂線蟲代謝和寄生行為方面具有很大的遺傳潛力(王瑞珍， 2017； Wangetal.， 2018a)。菌株CBS 115803的完整線粒體基因組通過(guò)PacBio RS II測(cè)序技術(shù)完成測(cè)序，環(huán)狀分子長(zhǎng)度為47 282 bp，GC含量為24.85%。注釋的基因包括14個(gè)保守的蛋白質(zhì)編碼基因，1個(gè)大的和1個(gè)小的rRNA亞基(rnl和rns)以及27個(gè)tRNA，通過(guò)對(duì)線粒體基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)伊氏線蟲菌與Sporothrix屬有較近的親緣關(guān)系(王瑞珍， 2017； Wangetal.， 2017a)。同時(shí)在菌株CBS100821、ATCC74485、CBS115803和CUN120806細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)生細(xì)菌，該內(nèi)生細(xì)菌隸屬于γ-變形菌門(Gammaproteobacteria)，球狀，細(xì)胞直徑在50 nm～2 μm之間，細(xì)胞壁厚度、細(xì)胞大小和繁殖程度在細(xì)菌生長(zhǎng)的前期和后期不同。該細(xì)菌與伊氏線蟲菌之間存在緊密的共生關(guān)系，目前還不可人工培養(yǎng)，對(duì)于該細(xì)菌的研究將有助于揭示內(nèi)生細(xì)菌在伊氏線蟲菌宿主進(jìn)化和生態(tài)學(xué)作用，該研究還需要進(jìn)一步進(jìn)行(王瑞珍， 2017)。

伊氏線蟲菌被報(bào)道時(shí)間不長(zhǎng)，所以對(duì)其分子層面的侵染機(jī)制還在不斷探索。目前，一個(gè)對(duì)松材線蟲具有強(qiáng)毒力的絲氨酸蛋白酶基因Evsp(GenBank登錄號(hào)KP698922)從菌株NKF13222被克隆出來(lái)。Evspcontains的全長(zhǎng)cDNA含有一個(gè)165 602 bp的ORF，編碼一個(gè)含有551個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)?；蚪MEvsp包括由內(nèi)含子(20 702 bp)分開(kāi)的2個(gè)外顯子(39 602 bp和126 002 bp)，真菌基因組中只有一個(gè)Evspgene拷貝。其與枯草溶菌素絲氨酸蛋白酶中的催化結(jié)構(gòu)域高度同源。通過(guò)基于絲氨酸蛋白酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，伊氏線蟲菌與內(nèi)寄生真菌、昆蟲病原真菌、產(chǎn)毒真菌及機(jī)會(huì)真菌有著較近的親緣。絲氨酸蛋白酶rEvsp能降解并破壞松材線蟲體壁，其可能在伊氏線蟲菌對(duì)松材線蟲侵染過(guò)程中起到重要作用。將約3.6 kb的線性融合片段轉(zhuǎn)化進(jìn)伊氏線蟲菌得到基因缺失突變體菌株ES84，其和野生型菌株NKF13222對(duì)松材線蟲的黏附率和侵染率差異不顯著，可能是伊氏線蟲菌的絲氨酸蛋白酶rEvsp在基因功能上存在冗余性(張龍， 2015； Wangetal.， 2015c)。

在野外試驗(yàn)中，僅通過(guò)顯微鏡觀察檢查伊氏線蟲菌是非常不方便和低效的，并且無(wú)法將月形孢子和其他真菌的菌絲體區(qū)分開(kāi)來(lái)。最近，將FTA-DNA提取和PCR擴(kuò)增結(jié)合起來(lái)，通過(guò)存在176 bp特異性片段從環(huán)境中檢測(cè)伊氏線蟲菌是一種簡(jiǎn)單易行的方法?；谝潦暇€蟲菌的幾丁質(zhì)酶基因設(shè)計(jì)的引物(上游5′-GTGCCTCTACCAAG ACTCGC-3′;下游5′-CGCCAAATGTCAAGATCCGC-3′)表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性，高靈敏度和效率，該方法為后續(xù)的研究提供了重要的技術(shù)支持。理論上，只要樣品含有的伊氏線蟲菌菌絲體或分生孢子，它們就可以被有效地檢測(cè)到(魏柯， 2014； Weietal.， 2014)。

7 在松材線蟲病防治中應(yīng)用

7.1 制劑劑型

如運(yùn)用伊氏線蟲菌進(jìn)行林間防治松材線蟲病，就要將其研制成為一種適應(yīng)野外生存條件，具有長(zhǎng)保質(zhì)期的制劑劑型。采用4%脫脂牛奶、0.2%腐植酸、5%山梨醇、0.05% CaCl2、延展劑和抗生素配方制成的孢制劑，在不利的環(huán)境條件下能對(duì)真菌孢子起到最有效的保護(hù)作用，并能提高該種真菌孢子應(yīng)對(duì)多種環(huán)境脅迫時(shí)的抵抗力和對(duì)線蟲的致死率(Wangetal.， 2012)。將伊氏線蟲菌加入2%海藻酸鈉和5%粘土制成的伊氏線蟲菌藻酸鹽 - 黏土制劑，是一種非真空包裝的制劑，在4℃中保存其孢子活力最強(qiáng)，而且能有效延長(zhǎng)伊氏線蟲菌的保質(zhì)期。添加了15%甘油、0.5%酵母提取物和0.5%草藥提取物制備的3種分生孢子制劑的保質(zhì)期也顯著延長(zhǎng)(Xueetal.， 2014b)。將10%高嶺土、0.1%司盤80、1%阿拉伯糖、5%山梨糖醇和5%PEG8000摻入海藻酸鈣凝膠膠囊中在-70 ℃保存1個(gè)月，伊氏線蟲菌分生孢子還保持較高的生存力(Wangetal.， 2016)。用珍珠巖作為真菌載體保存于液氮中，2天和1年后其均能保持原來(lái)的生長(zhǎng)，且其微生物形態(tài)未被改變(Homolkaetal.， 2007)。

7.2 使用方法

伊氏線蟲菌具有很高的開(kāi)發(fā)為一種防治松材線蟲病生物農(nóng)藥的潛力。在溫室和野外采用樹干注射、樹冠噴灑和傷口接種等不同方法施用含有該真菌的生防菌，均能降低松材線蟲對(duì)松樹的侵染，還在用該菌處理過(guò)的松樹中發(fā)現(xiàn)該菌菌絲、孢子和被月形孢子侵染的松材線蟲(Wangetal.， 2011a； Wangetal.， 2011b)。

樹干注射： 溫室試驗(yàn)和2年的林間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種的伊氏線蟲菌可以在松樹內(nèi)生長(zhǎng)繁殖并不斷侵染松樹內(nèi)的松材線蟲，可在4～5天內(nèi)殺死幾乎所有測(cè)試的松材線蟲(Sungetal.， 2010)。用300 μL和40 mL 伊氏線蟲菌分生孢子懸浮液(109個(gè)·mL-1)注射接種松樹幼苗和大樹，所有處理過(guò)的松樹都是健康的。此外，在木片上未觀察到由該真菌引起的壞死或變色(Wangetal.， 2011d)。

樹冠噴灑： 伊氏線蟲菌噴灑處理顯著提高了被松材線蟲感染的松樹幼苗的存活率。將3×108和3×106個(gè)·mL-1的伊氏線蟲菌分生孢子懸浮液噴灑在將要死亡的赤松(Pinusdensiflora)上，2個(gè)月后線蟲密度分別下降約79%和47%。同時(shí)，在接種松材線蟲前1個(gè)月將真菌噴灑到4年生松樹幼苗上時(shí)，幼苗的存活指數(shù)達(dá)到0.67，而沒(méi)有真菌噴灑的對(duì)照幼苗僅為0.067，并且在經(jīng)過(guò)處理的木材部分中觀察到伊氏線蟲菌感染的線蟲和菌絲(Wangetal.， 2011a)。在另一試驗(yàn)中，噴灑了107cfu·mL-1伊氏線蟲菌的植物比未處理的松樹幼苗的存活率高73.0%。在線蟲感染前14天用107cfu·mL-1伊氏線蟲菌處理松樹幼苗，其存活率提高了90.0%。從噴灑了伊氏線蟲菌的死松幼苗中分離的松木線蟲的數(shù)量比對(duì)照中的松材線蟲數(shù)量少76%。此外，在死亡或枯萎的松樹幼苗中可以檢測(cè)到被伊氏線蟲菌感染的線蟲和菌絲(Wangetal.， 2017b)。

傷口接種： 將被月形孢子黏附的松材線蟲(40%)懸浮液接種至赤松松苗上并置于溫室培養(yǎng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)幼苗枝條木段組織中有被染成藍(lán)色的線蟲和菌絲，在木段切片中還發(fā)現(xiàn)了正常線蟲，有的線蟲體表還能看到月形孢子和菌絲，偶爾能看到菌絲和月形孢子分散在木段切片中(Zhaoetal.， 2007)。在韓國(guó)晉州經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)6年的林間試驗(yàn)中，松樹在人工接種松材線蟲(PWN)感染前用伊氏線蟲菌處理，30%以上的樹存活6年，未經(jīng)過(guò)伊氏線蟲菌處理的樹全部死亡。同時(shí)，在6年后可以在處理過(guò)的松樹內(nèi)部檢測(cè)到伊氏線蟲菌的存在(Wangetal.， 2018b)。

8 展望

松材線蟲病是一種能造成松林成片毀滅的流行性病害，嚴(yán)重破壞了疫區(qū)生態(tài)系統(tǒng)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，控制松材線蟲病的傳染和制定防治策略極為重要。伊氏線蟲菌作為一種松材線蟲的內(nèi)寄生真菌，從自然界中分離，無(wú)毒，寄主范圍較小，不影響其他生物的生存，而且其能在松樹中存活，并用月形孢子繁殖寄生其他移動(dòng)的松材線蟲，具有作為一種真菌劑制防治松材線蟲病的潛力(Wangetal.， 2011d)。除真菌伊氏線蟲菌外，松材線蟲的生防微生物有食線蟲真菌、細(xì)菌和放線菌等。目前已經(jīng)有野外試驗(yàn)證明對(duì)松材線蟲病防治有效的生防微生物除了伊氏線蟲菌之外還有Smal-007(韓正敏等， 2013； 南京林業(yè)大學(xué)， 2014)。Smal-007是從美國(guó)松材線蟲體表分離篩選到的一株嗜麥芽窄食單菌(Stenotrophomnasmaltophilia)，該菌致病力弱、定殖和替代能力強(qiáng)、對(duì)環(huán)境安全無(wú)毒(曾腓力等， 2012； 賁愛(ài)玲等， 2013)。在福建三明市等地小面積的林間防治試驗(yàn)取得良好結(jié)果，但在噴灑該細(xì)菌后要保持48 h無(wú)雨，因?yàn)榻涤陼?huì)影響細(xì)菌的定殖(姚伍等， 2018)。Smal-007只能降低松材線蟲的致病力，并不能直接殺死線蟲，而伊氏線蟲菌是內(nèi)寄生于松材線蟲體內(nèi)，可殺死松材線蟲，2種生防菌的防治機(jī)制不同。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)真菌伊氏線蟲菌野外防治松材線蟲病做了初步研究。設(shè)置了A、B、C和D4組試驗(yàn)，研究了利用伊氏線蟲菌孢子懸浮液來(lái)預(yù)防松材線蟲病的可行性。3組試驗(yàn)分別為先噴灑孢子懸浮液和1周后接入松材線蟲(A處理)，噴灑孢子懸浮液的同時(shí)接入松材線蟲(B處理)，先接入松材線蟲和1周后噴灑孢子懸浮液(C處理)，只接線蟲不噴孢子懸浮液(D處理，對(duì)照)；線蟲接入量為每棵樹1 000頭，孢子懸浮液濃度為1×108個(gè)·mL-1，接入量為每棵10 mL。試驗(yàn)結(jié)果表明A組在接種完線蟲的第2個(gè)月開(kāi)始出現(xiàn)枯萎癥狀，比其他處理表現(xiàn)出癥狀要更緩、更少。A、B和C不同處理對(duì)線蟲的侵染活力上存在差異，D組大部分松樹遭到了嚴(yán)重的為害，表現(xiàn)出松針變黃、大部分枯萎和死亡。初步證明運(yùn)用伊氏線蟲菌孢子懸浮液來(lái)預(yù)防松材線蟲病具有一定的可行性，但是最佳預(yù)防時(shí)間等其他的條件還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。除上述試驗(yàn)外，本實(shí)驗(yàn)室還對(duì)松褐天牛與真菌伊氏線蟲菌的相互作用關(guān)系進(jìn)行了初步試驗(yàn)。設(shè)置了天牛取食的松樹枝噴灑孢子懸浮液和天牛浸泡孢子懸浮液再取食松樹枝2個(gè)初步試驗(yàn)，研究伊氏線蟲菌是否可以通過(guò)松褐天牛取食松枝的傷口進(jìn)入松樹內(nèi)。結(jié)果表明這2個(gè)處理間差異不顯著，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，直接噴灑在樹枝上的孢子侵染的能力相對(duì)要強(qiáng)。

綜上所述，噴灑伊氏線蟲菌孢子懸浮液能在一定程度上保護(hù)松樹，盡管效果沒(méi)有化學(xué)藥劑快，但該菌是一種非常有潛力的可用于防治松材線蟲的天敵。目前對(duì)伊氏線蟲菌的生物防治研究還在初期階段，林間的推廣應(yīng)用要考慮壞境和氣候等多方面的因素的綜合影響。盡管在試驗(yàn)中伊氏線蟲菌有明顯的致死松材線蟲的效果，但松材線蟲病是松樹、病原松材線蟲、媒介松褐天牛、真菌等微生物、各種環(huán)境和氣候條件之間復(fù)雜的相互作用造成的，伊氏線蟲菌侵染松材線蟲的效力會(huì)受到這種復(fù)雜性的影響。因此還需要大量的研究來(lái)進(jìn)一步推進(jìn)該菌的應(yīng)用，下一步應(yīng)該增加林間防治試驗(yàn)的研究，探明防治的最佳條件，如防治時(shí)間，防治次數(shù)和劑量等，形成一套完整的防治方案。同時(shí)，目前關(guān)于伊氏線蟲菌的研究主要集中在其與松材線蟲之間。松褐天牛作為松材線蟲的攜帶者，是松材線蟲病的傳播媒介，其與伊氏線蟲菌之間的關(guān)系也值得深入研究，可為松褐天牛與伊氏線蟲菌相結(jié)合防治松材線蟲病提供基礎(chǔ)。