馬來酰亞胺熒光探針及其在硫醇檢測中的研究進展

武文聰 Nathaniel S. Finney

摘 ?????要：半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）等生物硫醇分子在維持生命體系的穩(wěn)定中具有至關重要的作用。因此，對其進行精準快速地檢測具有重要意義。馬來酰亞胺類熒光探針因具有快速且高選擇性的檢測生物硫醇分子的性能，已經成為一種檢測以上硫醇分子的重要手段，其研究近年來已取得了較大的進展。根據(jù)馬來酰亞胺類熒光探針設計的多樣性，主要對N-取代基馬來酰亞胺、雙馬來酰亞胺和溴代馬來酰亞胺類熒光探針的研究現(xiàn)狀及在生物硫醇檢測中的應用進行了介紹。

關 ?鍵 ?詞：馬來酰亞胺;生物硫醇;熒光探針;研究進展

中圖分類號：TQ 422 ?????文獻標識碼：?A ?????文章編號： 1671-0460（2020）01-0240-05

Research Progress of Maleimide-based?Fluorescent

Probes?for Detection of Thiols

WU Wen-cong， Nathaniel S. Finney

（School of Pharmaceutical Science?and Technology， Tianjin University， Tianjin 300072， China）

Abstract： Biological thiols including cysteine （Cys）， homocysteine （Hcy） and glutathione （GSH） play a crucial role in maintaining the stability of the living system. Therefore， it is necessary to carry out accurate and rapid detection for biothiols. Because of rapid and highly selective detection characteristics of maleimide-based fluorescent probes， they have been the important method for detecting biothiols， and their research has made great progress in recent years. In this paper， based on the diversity of maleimide-based fluorescent probes， the study status of N-substituted maleimide， bismaleimide and bromomaleimide fluorescent probes was introduced as well as their application in biothiol detection.

Key words： Maleimide;?Biological thiols;?Fluorescent probes;?Research progress

生物硫醇化合物具有獨特的化學反應性，在維持生命體系的穩(wěn)定中具有至關重要的作用，半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是其代表性分子。其中，Cys具有維持蛋白質結構和功能的作用，Cys缺乏會導致兒童生長緩慢、毛發(fā)脫色、肝損傷、肌肉和脂肪損失、皮膚損傷等多種綜合征^[1];Hcy與機體生化水平密切相關，體內Hcy濃度異常會導致阿爾茨海默氏癥、心血管疾病以及葉酸和維生素B12缺乏等多種疾病;GSH是體內含量最多的生物硫醇小分子，與維持細胞內氧化還原活性、異質代謝、細胞內信號傳導和基因調控等功能密切相關^[2]。因此，對生物硫醇進行高靈敏度和高選擇性的檢測，并探究其在生理病理的生物活性對生化研究及臨床診斷具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的檢測生物硫醇方法包括高效液相色譜、毛細管電泳分離、電化學以及質譜法等，然而這些方法所需成本高、檢測時間長、選擇性差，很難直接應用于原位檢測^[1，3]。在所有硫醇檢測方法中，熒光探針基于其操作簡單、分辨率高、可選擇性、靈敏度高、檢測限低以及可細胞內成像等優(yōu)點^[4]，近年來得到了廣泛的發(fā)展和應用。

馬來酰亞胺在反應速率、選擇性和產率方面具有獨特的反應性，且對空氣、水和熱有良好的穩(wěn)定性，同時，可以直接與多種生物分子中天然存在的硫醇發(fā)生反應^[5，6]，現(xiàn)廣泛用于生物硫醇的檢測。目前，已有超過30種的馬來酰亞胺類熒光探針被報道。

1 ?馬來酰亞胺類熒光探針反應原理

基于馬來酰亞胺基團的熒光探針多屬于“開-關（On-Off）”型探針：其結構通常為熒光團與馬來酰亞胺基團共軛連接，見圖1，由于該連接會導致熒光淬滅，探針處于“關”熒光狀態(tài);在與生物硫醇分子發(fā)生邁克爾加成反應后，共軛體系被中斷，熒光團的熒光恢復，使探針處于“開”熒光狀態(tài)^[7]。

馬來酰亞胺類探針的熒光淬滅機理包括光誘導電子轉移（PET）和分子內電荷轉移（ICT）兩種，探針與硫醇的反應原理見圖1?；赑ET機理設計的熒光探針，其熒光團與馬來酰亞胺（識別基團）組成一對電子給體和電子受體，在光的激發(fā)下熒光團和識別基團之間發(fā)生電子轉移，使馬來酰亞胺基團的最低空軌道（LUMO）或最高占據(jù)分子軌道（HOMO）位于熒光團的LUMO和HOMO之間，導致熒光團的激發(fā)電子無法回到基態(tài)^[5]，發(fā)生熒光淬滅;當探針與硫醇分子發(fā)生加成反應后，PET效應被抑制，從而恢復熒光?；贗CT機理構建的探針在與被測物反應前后，探針的電子供體或電子受體的給電子或吸電子能力發(fā)生改變，導致整個熒光探針的電子分布發(fā)生改變，從而影響其吸收光譜的變化^[7，8]。目前報道的馬來酰亞胺類熒光探針多是基于PET原理構建得到的。

2 ?馬來酰亞胺類熒光探針

2.1 ?N-取代馬來酰亞胺類熒光探針

2.1.1 ?N-芳基馬來酰亞胺類熒光探針

馬來酰亞胺基團直接與熒光團的芳基相連接，熒光強度可增強6～286倍，量子產率增大21～350倍。目前已報道的馬來酰亞胺類熒光探針大部分為N-芳基馬來酰亞胺。

早在1981年，Sippel報道了N-（4-（7-二乙氨基-甲基香豆素-3-基）苯基）馬來酰亞胺（CPM，1）用于硫醇的標記，其化學結構見圖2。該探針易于制備和純化，結構穩(wěn)定，可溶于簡單的溶劑混合物，在pH中性范圍內具有高反應性，與硫醇縮合后可產生明亮的藍色熒光^[9]，基本性質見表1。然而，該探針在檢測過程中，背景熒光干擾過大，導致其進一步應用受限。近期，已證明CPM在檢測含硫醇基團的組蛋白乙酰轉移酶（HAT）活性時，具有顯著地熒光增強現(xiàn)象^[10]。

Matsumoto設計合成了基于BODIPY熒光團的探針o-馬來酰亞胺-BODIPY（2），其結構見圖2。其中，BODIPY作為電子供體，馬來酰亞胺部分作為電子受體，基于供體激發(fā)光誘導電子轉移（d-PET）的機理，使探針發(fā)生熒光淬滅^[11]。作者通過比較馬來酰亞胺位于BODIPY的鄰位、間位和對位時三種探針的熒光強度，發(fā)現(xiàn)只有鄰位衍生物的熒光幾乎完全淬滅，這表明電子供體和電子受體之間的距離越近，熒光被淬滅得越完全。探針2可通過可見光激發(fā)，具有極高的信噪比，具體參數(shù)見表1，可用于定量標記低濃度的牛血清蛋白（BSA）。

Kand等報道了基于苯并吡喃-喹啉的馬來酰亞胺類熒光探針3^[8]，馬來酰亞胺位于苯并吡喃-喹啉環(huán)的C-4位置，其結構見圖2，具有很高的電子密度，時間分辨熒光光譜顯示其具有較低的k_r/k_nr值（k_r/k_nr=0.005）。基于ICT原理，探針3顯示出對生物硫醇快速且高選擇性的響應：與Hcy、Cys和GSH反應，熒光強度分別可提高180、205和245倍，其他熒光性質見表1。其中，對GSH的響應最好，這是因為該探針C-4位置的空間位阻較大，且GSH分子較大，使得馬來酰亞胺與喹啉基團幾乎處于正交的構象（鍵角為87.9°），降低了馬來酰亞胺對熒光團的淬滅能力。通過使用96孔板系統(tǒng)的裸眼檢測以及活細胞成像已證明其可以作為定量硫醇探針使用。

Liu等合成了含有三苯胺和馬來酰亞胺的新型硫醇反應型熒光探針4，具體結構見圖2，該探針具有良好的水溶性，細胞穿透能力和生物相容性^[12]。在生理pH=7.4條件下，基于探針4濃度的不同，可選擇性檢測硫醇：濃度較低（0.5 mmol/L）時，Hcy/GSH誘導熒光顯著增強（24倍），而Cys幾乎沒有變化;加大探針濃度至5 mmol/L，可觀察到Cys誘導的熒光增強（12倍）。探針4與Hcy和GSH反應時間為75?s，與Cys的反應時間為150 s。此外，該探針已成功應用于活細胞的熒光成像，但是該探針的激發(fā)和發(fā)射波長均在紫外區(qū)域（吸收與發(fā)射波長見表1），不利于其進一步應用。

Zhao等基于PET機制和激發(fā)態(tài)質子轉移（ESIPT）機理，開發(fā)了用于選擇性檢測水溶液中硫醇的“Turn-on”型熒光探針5，其化學結構見圖2。該探針可以高選擇性地檢測Cys：具有快速的熒光響應，與Cys的反應在30 s內達到平衡;檢測限極低，為3.78×10^-8M?（S/N=3）;在生理pH范圍內對Cys顯示出良好的熒光響應，信噪比較高^[13]。該探針具有良好的細胞膜通透性和對細胞內硫醇的反應性，已成功應用于活細胞中硫醇的成像。

2.1.2 ?N-烷基馬來酰亞胺類熒光探針

N-烷基馬來酰亞胺類化合物是一類常見的檢測生物硫醇的熒光探針，與芳基直接和馬來酰亞胺基團相連接的探針不同，探針和馬來酰亞胺中間間隔烷基，此類熒光探針標記效果略低于N-芳基馬來酰亞胺類熒光探針，亮度增強5～45倍，量子產率擴大3～20倍。

Lv等報道了一種新的衍生化試劑咔唑-9-乙基-2-馬來酰亞胺（CAEM， 6），其中咔唑單元作為核心發(fā)色團，馬來酰亞胺基團作為反應功能團^[14]。探針化學結構見圖3。

該設計大大降低了背景熒光，顯著提高了檢測靈敏度。在PBS緩沖液（0.02 mol/L， pH=7.5）中，溫度40 ℃時，探針6的基本性質見表2，與硫醇反應10 min，即可得到穩(wěn)定的熒光衍生物。該探針具有較高的巰基選擇性，檢測限可達到8～17.1 pmol/L。此外，由于其穩(wěn)定性高，線性范圍寬，已成功應用于測定廢水樣品中的硫醇。

Freimuth報道了基于二氨基對苯二甲酸酯基團的馬來酰亞胺類探針7，通過在馬來酰亞胺和熒光團之間引入乙基作為連接基團，具體結構見圖3，可將發(fā)射波長移向光譜的紅色區(qū)域^[15]。探針7的量子產率非常低（Φ=0.002），熒光基本參數(shù)見表2。與芐基硫醇發(fā)生共軛加成反應后，熒光可增強20倍。

2.1.3 ?N-胺基馬來酰亞胺類熒光探針

Qu等設計并合成了一種基于1，8-萘二甲酸酐熒光團的馬來酰亞胺類新型硫醇反應型熒光探針8，化學結構見圖4。該探針在4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液（10 mmol/L，pH=7.4）中，隨著Hcy濃度的增加，熒光信號逐漸增強，大約為4倍（Φ=0.065～0.192），可直接觀察到溶液顏色從無色到藍色^[16]。對于Hcy、Cys和GSH，其對應檢測限分別為：0.144、0.135和0.088 5 μmol/L，其他熒光性質見表3。探針8在實驗條件下與硫醇可快速反應（響應時間為20 s），提供了定量檢測的可能性，無需對樣品進行任何預處理。

Li等合成了含有馬來酰亞胺基團的1，8-萘二甲酰亞胺基探針9，化學結構見圖4。在HEPES/DMSO?（10 mmol/L，pH=7.4） 溶液中，探針9溶液的發(fā)射強度與Cys的添加量呈線性關系，并且可以在4.0至11.0的寬pH范圍內響應Cys，檢測限低至10^-8mol/L，具體熒光性質見表3。檢測速度快，對于Cys，Hcy和GSH，反應在120 s內完成^[17]。并且，共聚焦熒光成像實驗證明探針9可以很容易地進入細胞并進行硫醇的熒光檢測。

2.2 ?雙馬來酰亞胺類熒光探針

Girouard報道了一種新的馬來酰亞胺類探針10，該探針含有兩個連接到萘酰亞胺熒光團的馬來酰亞胺基團，其結構見圖5。探針10與硫醇和二硫醇反應表明，當其與僅含有一個Cys的蛋白質反應時，不會導致熒光增加;當添加第2當量的硫醇后熒光很快增強，幾乎可以定量的轉化為二硫醇加合物^[18]。探針10與乙硫醇反應后，在DMSO中發(fā)出的熒光強度可增加20倍，該變化在微摩爾濃度很容易被檢測到，其他性質見表4。探針10可對存在兩個Cys殘基的α-螺旋重組蛋白在體外進行標記。

Castonguay等設計了以熒光素作為熒光團的雙馬來酰亞胺類探針11，其結構見圖5，該探針可與帶有兩個Cys殘基的α-螺旋目標肽序列dC10反應，進行目標蛋白的共價熒光標記。在含有5% DMSO的HEPES?（50 mmol/L， pH=7.5） 溶液中，探針11與2 當量的巰基丙酸（MPA）反應后的熒光強度增加5.8倍，見表4。已證明此探針可用于標記表皮生長因子受體 （EGFR），進而提供了膜蛋白特異性標記的可能^[19]。

Clouthier等發(fā)表了基于香豆素熒光團的雙馬來酰亞胺類熒光探針12，其結構見圖5。通過引入甲氧基，對馬來酰亞胺進行抑制，降低其與GSH反應活性，但保持與dC10α修飾的麥芽糖結合蛋白（MBP-dC10α）的反應性^[20]。探針與測試蛋白MBP-dC10α反應后的熒光增強比率為74，見表4。最重要的是探針12具有無毒性，可不經過洗滌而直接在活細胞中高度特異性地標記巰基蛋白。

2.3 ?溴代馬來酰亞胺類熒光探針

2009年，Baker報道了溴代馬來酰亞胺作為可調節(jié)的邁克爾受體，其結構見圖6，可與Cys迅速反應，是一類用于選擇性和可逆修飾Cys的新試劑^[21]。溴代-N-甲基馬來酰亞胺（13）可與N-Boc-Cys-OMe快速反應（< 1 min），且通過競爭實驗證明溴代馬來酰亞胺反應速率快于馬來酰亞胺。最特殊的是，探針與Cys反應生成的硫代馬來酰亞胺共軛物可用三（2-羧乙基）膦（TCEP）裂解，重新得到Cys，因而13的報道使半胱氨酸的可逆標記成為可能。

基于上述研究，Baker設計并合成了溴代馬來酰亞胺類熒光探針14，選擇Dansyl作為熒光團，結構見圖6。探針14與1當量的N-Boc-Cys-OMe反應^[22]，生成單硫代馬來酰亞胺共軛物（Φ=0.049），繼續(xù)添加1當量的N-Boc-Cys-OMe后，得到的二硫代馬來酰亞胺共軛物，并且熒光增強（Φ=0.11）。探針14直接與二硫醇反應，熒光可增強13倍（Φ=0.022～0.28）。證明溴代馬來酰亞胺類熒光探針可作為選擇性熒光標記二硫醇的新型試劑。

3 ?結論

近年來，生物硫醇熒光探針研究取得了很大的進展，其中馬來酰亞胺類熒光探針由于可選擇性的與生物硫醇分子發(fā)生反應，一直是研究的熱點。然而，對此類探針的研究也面臨著新的挑戰(zhàn)，如對于Cys、Hcy和GSH的專一性檢測報道較少，探針的可逆性標記有待研究，基于體內細胞器靶向的硫醇探針沒有重大突破等。因此，未來關于檢測生物硫醇的馬來酰亞胺類熒光探針的研究重點如下：（1）設計針對生物硫醇分子的專一性檢測探針;（2）探究可逆馬來酰亞胺類熒光探針的可行性;（3）研究適用于生物細胞器靶向的熒光探針。

參考文獻：

[1]Xiaoqiang Chen，Ying Zhou， Xiaojun Peng，et al. Fluorescent and colorimetric probes for detection of thiols[J]. Chemical Society Reviews， 2010， 39：2120-2135.

[2]Hanjing Peng， Weixuan Chen， Yunfeng Cheng，et al. Thiol reactive probes and chemosensors[J]. Sensor， 2012， 12：15907-15946.

[3]Liya Niu， Yuzhe Chen， Hairong Zheng， et al. Design strategies of fluorescent probes for selective detection among biothiols[J]. Chemical Society Reviews， 2015， 44：6143-6160.

[4]Peipei Yan， Ting Wang， Dan Zhang， et al. The progress in fluorescence sensors for detection of thiols[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry， 2018， 38：1-22.

[5]Kevin Renault， Jean Wilfried Fredy， Pierre-Yves Renard， et al. Covalent modi?cation of biomolecules through maleimide-based labeling strategies[J]. Bioconjugate Chemistry， 2018， 29：2497-2513.

[6]Ravasco， Joao M. J. M.; Faustino， Helio; Trindade， Alexandre. Bioconjugation with maleimides： a useful tool for chemical biology[J]. Chemistry-A European Journal， 2018， 25：43-59.

[7]Yongzhi Lv， Xueyi Feng， Luxiang Liu， et al. The review of luminescence mechanism of fluorescent probes[J]. Fujian Analysis and Testing， 2017， 26：25-30.

[8]Dnyaneshwar Kand， Arunasree Marasanapalli Kalle ， Pinaki Talukdar. Chromenoquinoline-based thiol probes： a study on the quencher position for controlling fluorescent off-on characteristics[J]. Organic & Biomolecular Chemistry， 2013， 11：1691-1701.

[9]Sippel， T. O. New fluorochromes for thiols： maleimide and iodoacetamide derivatives of a 3-phenylcoumarin fluorophore[J]. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry， 1981， 29：314-316.

[10]Tielong Gao， Chao Yang， ， Yujun George Zheng. Comparative studies of thiol-sensitive fluorogenic probes for HAT assays[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2013， 405：1361-1371.

[11]Takuya Matsumoto， Yasuteru Urano， Takuji Shoda， Hirotatsu Kojima， and Tetsuo Nagano. A thiol-reactive fluorescence probe based on donor excited photoinduced electron transfer： key role of ortho substitution[J]. Organic Letters， 2007， 9：3375-3377.

[12]Tao Liu， Fangjun Huo， Caixia Yin， et al. A triphenylamine as a fluorophore and maleimide as a bonding group selective turn-on fluorescent imaging probe for thiols[J]. Dyes and Pigments， 2016， 128：209-214.

[13]Yun Zhao， Yuanyuan Xue， Haoyang Li， et al. An excited state intramolecular proton transfer dye based fluorescence turn-on probe for fast detection of thiols and its applications in bioimaging[J]. Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2017， 175：215-221.

[14]Zhengxian Lv， Zhiwei Sun， Cuihua Song， et al. Sensitive and background-free determination of thiols from waste water samples by MOF-5 extraction coupled with high-performance liquid chromatography with fluorescence detection using a novel fluorescence probe of carbazole-9-ethyl-2-maleimide[J]. Talanta， 2016， 161： 228-237.

[15]Lena Freimuth，Jens Christoffers. Bifunctional diaminoterephthalate scaffolds as fluorescence turn-on probes for thiols[J]. Chemistry-A European Journal， 2015， 21：8214-8221.

[16]Lijun Qua， Caixia Yina， Fangjun Huo， et al. A maleimide-based thiol fluorescent probe and its application for bioimaging[J]. Sensors and Actuators B Chemical， 2014， 195：246-251.

[17]Tao Liua， Fangjun Huo， Jianfang Li，et al. A fast response and high sensitivity thiol fluorescent probe in living cells[J]. Sensors and Actuators B Chemical， 2016， 232：619-624.

[18]Alain Grandbois， Jeffrey W. Keillor， Stephen W. Michnick， et al. Synthesis and characterization of dimaleimide fluorogens designed for specific labeling of proteins[J]. Journal of the American Chemical Society， 2005， 127：559-566.

[19]Julia Guy， Roselyne Castonguay， Stephane Dufresne， et al. De novo helical peptides as target sequences for a specific， fluorogenic protein labelling strategy[J]. Molecular BioSystems， 2010， 6： 976-987.

[20]Yingche Chen， Christopher M. Clouthier， Kelvin Tsao， et al. Coumarin-based fluorogenic probes for no-wash protein labeling[J]. Angewandte Chemie International Edition， 2014， 53：13785-13788.

[21]Lauren M. Tedaldi， Mark E. B. Smith， Ramiz I. Nathani， et al. Bromomaleimides： new reagents for the selective and reversible modification of cysteine[J]. Chemical Communications， 2009， 6583- 6585.

[22]Judith Youziel， Ahmed R. Akhbar， Qadeer Aziz， et al. Bromo- and thiomaleimides as a new class of thiol-mediated fluorescence ‘turn-on reagents[J]. Organic & Biomolecules Chemistry， 2014， 12： 557-560.