黃芪黃酮含量測定實驗適用于職業(yè)院校生物學實驗教學的探究*

顏珊珊 邵亞洲 梁俊玉

（西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070）

職業(yè)院校是我國人才培養(yǎng)的重要組成部分，以培養(yǎng)符合社會經(jīng)濟發(fā)展需要的專業(yè)技能人才為己任。目前，我國處于經(jīng)濟上升時期，需要大批具有創(chuàng)新、創(chuàng)業(yè)能力的人才，這就要求職業(yè)院校在人才培養(yǎng)過程中要將創(chuàng)新、實踐實訓能力和應用能力等作為培養(yǎng)的主要目標［1］。實驗教學是職業(yè)院校生物學教學的重要環(huán)節(jié),學生可通過實驗親身操作、主動發(fā)現(xiàn)，從而尋求自身的主動發(fā)展，提高實驗操作技能和促進思維的多向發(fā)展［2］。

黃芪為豆科多年生草本植物膜莢黃芪［As tragalus membranaceus（Fisch.Bge.）和蒙古黃芪(Astragalus membraneceus（Fisch.Bge.）var.monghlicus（Bge.） Hsiao］的干燥根，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表之功效，古有“補藥之長”之稱。黃酮類物質(zhì)作為中藥黃芪的主要有效成分。近年來，對黃芪黃酮類物質(zhì)的研究主要集中在抗輻射損傷、清除氧自由基、調(diào)控離子通道蛋白、增強免疫、抗病毒等方面；對于細胞保護、心律失常性疾病、感染性疾病有很好的應用前景［3］。目前實驗室對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測定方法主要包括紅外光譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法。本次教學主要以甘肅省隴西縣本地黃芪為原材料,將黃芪黃酮類毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定實驗作為職業(yè)院校生物學實驗的內(nèi)容進行嘗試,證實黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定在實驗教學中的各環(huán)節(jié)均具有可控性,學生可順利完成實驗并得到較好的實驗結果，利于實驗課堂教學目標的有效達成。

1 黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的實驗教學設計

1.1 教學目標

1）知識目標：①通過收集與查閱相關資料，對中草藥黃芪和黃酮類物質(zhì)的藥用價值產(chǎn)生濃厚的學習興趣，并認識到黃酮類物質(zhì)的研究價值。②掌握黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的基本步驟，明確實驗過程中的關鍵環(huán)節(jié)和注意事項。

2）能力目標：①學會高效液相色譜（HPLCELSD）、旋轉蒸發(fā)儀等實驗設備的使用及注意事項。②學會組裝回流裝置，并能說出搭建回流裝置的原理。③能獨自制作黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的標準曲線,計算黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。

3）情感態(tài)度與價值觀目標：認識到中草藥黃芪和黃酮類物質(zhì)的藥用價值及研究前景,加深對中藥材的學習興趣。

1.2 實驗教學活動組織 實驗前，學生主動收集并查閱中藥材黃芪和黃酮類物質(zhì)的相關資料，教師制定實驗方案并對全班進行分組,采用小組合作進行實驗教學。學生對實驗基本步驟有了初步了解。實驗教學活動中，每組成員必須全部參與到活動中，親自操作，互學互助。教師在旁引導，啟發(fā)學生思考，主動發(fā)現(xiàn)、解決問題。實驗教學活動結束后，各組匯報實驗結果，進行小組討論，思考實驗過程中的注意事項與易錯環(huán)節(jié)，合作交流，共同進步，最后教師進行總結。

1.3 實驗教學安排

1.3.1 材料與儀器

1）試劑與儀器。①試劑：黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（純度為95%）、色譜純乙腈和甲醇、分析純甲醇、超純水、0.2%甲酸溶液。②儀器：4 號篩子、圓底燒瓶、冷凝管、25 mL 大肚移液管、高效液相色譜儀、旋轉蒸發(fā)儀、水浴鍋、粉碎機。

2）材料準備。選用甘肅省隴西縣黃芪，依據(jù)黃芪根部的大小，分為粗、細及混合樣品。取適量黃芪，置于50℃的恒溫烘箱中，除去水分（直至烘干前后質(zhì)量相差不到0.1 g）。用粉碎機將黃芪粉碎，過4 號篩子，備用。

1.3.2 實驗操作步驟與流程［4］

1）色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜乙腈為流動相A，0.2%甲酸溶液為流動相B。按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為260 nm，紫外檢測器檢測。

表1 黃芪黃酮中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定

2）對照品溶液的制備：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL 含50 μg 的溶液，即得。

3）供試品溶液的制備：取本品粉末（過4 號篩）約l g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量。加熱回流4 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量。搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

4）測定法：分別精密吸取對照品溶液，供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀。

5）標準曲線的制備：分別精密量取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品貯備液適量,用分析純甲醇制備成系列濃度梯度,按照上述色譜條件分別進樣20 μL，測定。以峰面積值（y）為縱坐標，對照品濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線。黃芪黃酮中毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為：y=0.9159x-3.3246（R2=0.999）。

1.4 實驗結果與分析

1.4.1 實驗結果 黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定對實驗室操作規(guī)范程度并不苛刻,只要學生按照教師的要求嚴格操作,一般都能得到較好的實驗結果。

本次實驗中，全班共24 人，分成3 組。3 個小組分別根據(jù)黃芪根部大小進行實驗，即分別以黃芪粗、細和混合樣品為材料，測其毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。3 個小組都得到了較好的實驗結果（圖1），1 組選擇以黃芪粗粉為原材料，上樣后發(fā)現(xiàn)黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰時間為6.5 min 左右，色譜峰分離效果明顯，無平峰，皆為單峰且峰型尖銳，呈對稱狀。該HPLC 圖譜說明整個實驗流程中未出現(xiàn)雜質(zhì)干擾，學生實驗操作得當。同時，實驗發(fā)現(xiàn)無論黃芪根部粗細如何,其毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量皆在0.07%左右，且細粉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量略低于黃芪粗粉和混合粉（表2），說明黃芪根部粗細對毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測定結果影響不大,即最終實驗結果顯示甘肅隴西縣本地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.073%。

圖1 甘肅隴西縣本地黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的HPLC 圖

表2 甘肅隴西縣本地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

1.4.2 實驗注意事項

1)毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液必須在48 h內(nèi)使用，遵守現(xiàn)配現(xiàn)用原則。

2）涉及到“精密稱定”“精密量取”字樣時，要分別使用精確到4 位數(shù)的電子天平和大肚移液管。

3）在供試劑準備過程中，實驗保留續(xù)慮液，這里的“續(xù)濾液”指的是液體過濾時，開始濾過的部分液體選擇棄去，余下濾液稱為續(xù)濾液。

2 實驗教學活動總結與反思

職業(yè)院校以培養(yǎng)技術技能人才為己任,著重培養(yǎng)學生操作動手能力。對此，教師應選擇合理的教學方式，因材施教，采用多種方式激發(fā)學生學習興趣。

1）貫徹“以學生為主體，教師引導”的教學方式，進行啟發(fā)式教學。實驗教學過程中，教師要始終將學生放在主體地位，讓學生自主交流，自主思考，主動發(fā)現(xiàn)問題，思考解決問題的辦法。教師在旁觀察學生，在恰當時刻引導學生，啟發(fā)學生，而非對學生進行“填鴨式”教學，禁錮學生思維的多向發(fā)展。

2）采用合作學習教學策略，培養(yǎng)學生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題能力。黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷測定實驗簡單，操作少，但同樣離不開小組成員的相互合作，例如黃芪樣品的制備，高效液相流動相的配制等需要小組成員的分工合作。同時，教師要鼓勵小組成員全體參與到實驗中，體驗參與實驗的樂趣。在合作學習過程中，小組成員積極思考，親自操作，主動發(fā)現(xiàn)問題，共同思考解決問題的方式。

3）采取實驗室教學，培養(yǎng)學生生物科學素養(yǎng)。在實驗教學過程中,學生可直接觀察中藥材黃芪的形態(tài)特征，認識到黃芪的研究價值，明確實驗教學的教學目標與小組任務。同時，采取實驗教學的方式，學生可在活動中親身實踐，鍛煉自身實驗操作能力，培養(yǎng)生物科學素養(yǎng)。