新型生物抗菌修補片抑菌效果和安全性的實驗研究

程文悅，劉耀婷，陳金水，王 強，張 劍

生物補片天然具備一定的耐受感染能力，較多地應用于污染創面，是目前應用于伴有污染或感染缺損修復的唯一選擇。但不可否認的是，生物補片耐受感染的機制是其能實現早期局部快速再血管化、吞噬細胞早期進入，細菌生物膜難以形成[1]，因此其僅是耐受感染而不是抗感染，其自身并沒有抗微生物活性[2]。生物補片應用于修復明顯污染或感染的腹壁缺損時失敗率仍較高,并且失敗的病例均合并有手術部位感染[3]。另有研究提示生物補片能否耐受感染跟植入時定植的細菌量有關，當細菌超過吞噬細胞的清除能力，則生物補片內細菌同樣可以形成生物膜，分泌出大量膠原酶導致生物補片迅速崩解[4]。因此，生物補片亟需提升抗感染性。本研究擬篩選合適的抗菌劑與豬小腸黏膜下層脫細胞基質復合制備新型生物抗菌修補片，確認其抗菌性、抗菌劑釋放和安全性，為污染創面的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 三氯生(2,4,4-三氯-2-羥基二苯醚，Sigma-Aldrich)、硝酸銀(Sigma-Aldrich)、苯扎溴銨(十二烷基二甲基芐基溴化銨，Sigma-Aldrich)、乙醇(國藥)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(上海科瑪嘉微生物技術有限公司)、胰酪大豆胨肉湯培養基(上海科瑪嘉微生物技術有限公司)、Mueller-Hinton瓊脂平板(上海科瑪嘉微生物技術有限公司)、二氯甲烷(國藥)、甲醇(Thermo)、L929細胞由海軍軍醫大學附屬長征醫院實驗診斷科惠贈。

1.1.2 菌種 金黃色葡萄球菌(ATCC25923，Staphylococcus aureus，Sau)、大腸埃希菌(ATCC25922，Escherichia coli，Eco)、銅綠假單胞菌(ATCC27853, Pseudomonas aeruginosa, Pae)、表皮葡萄球菌(臨床質控菌株201413，Staphylococcus epidermidis，Sep)、嗜麥芽窄食單胞菌(ATCC17066，Stenotrophomonas maltophilia，Sma)，由海軍軍醫大學附屬長征醫院實驗診斷科惠贈。

1.2 方法

最低抑菌濃度的篩選采用肉湯稀釋法和細菌生物膜形成實驗。

1.2.1 供試菌的準備 用無菌接種環沾取Sau、Eco、Pae、Sep、Sma菌株接種于胰酪大豆胨瓊脂培養基(tryptose soya agar, TSA)平皿，表面分區劃線，37 ℃培養過夜。挑選1～2菌落種植于胰酪大豆胨肉湯培養基(tryptose soya broth, TSB)中，37 ℃、200 r/min(離心半徑r=10 cm)振蕩培養4 h，取菌液測定吸光度，調整菌液濃度至105CFU/ml)。

1.2.2 肉湯稀釋法抑菌效果實驗 制備三氯生、硝酸銀、苯扎溴銨儲備液。96孔板加入100 μl/孔菌液(Sau、Eco、Pae、Sep)和稀釋后的100 μl/孔抗菌劑溶液，調整抗菌劑濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L。設立抗菌劑空白對照和培養基空白對照。37 ℃培養24 h，測定570 nm波長處的吸光度。

1.2.3 細菌生物膜形成實驗 96孔板加入200 μl/孔菌液(Sep、Sma)，37 ℃培養24 h。棄菌液，加入無菌PBS(200 μl/孔)洗去未粘附菌，重復洗滌3次。加入100 μl/孔抗菌劑溶液(濃度梯度與肉湯稀釋法相同)，37 ℃培養24 h。加入50 μl/孔Bouin固定液，固定1 h。吸出固定液，無菌PBS 洗滌4次。每孔加入1滴0.4%結晶紫染液(以覆蓋孔底為準)，染色1 min。輕輕洗去未附著的染料，晾干，測定570 nm波長處的吸光度。以單純培養基為空白對照。

1.2.4 生物抗菌修補片的制備 以乙醇溶解三氯生，制備為儲備液。取新鮮豬小腸，機械去除腸壁肌層、漿膜層和黏膜層，獲得豬小腸黏膜下層。Abraham法[5]制備豬小腸黏膜下層脫細胞基質(small intestinal submucosa，SIS)。將三氯生儲備液涂布于SIS表面，8層SIS疊加成型，環氧乙烷滅菌后制備為生物抗菌修補片(triclosan-SIS，TSIS)。

1.2.5 抑菌圈實驗 調整Eco、Sau菌液濃度至106CFU/ml，均勻涂抹Mueller-Hinton 瓊脂平板，37 ℃培養24 h后將裁剪至1 cm×1 cm大小的TSIS補片貼于板面。每日更換新的平板，將補片揭下再次貼于新的板面，同法處理至無抑菌圈為止。每天測量抑菌圈直徑(mm)。

1.2.6 體外釋放實驗 將補片貼于瓊脂培養基表面，每天更換培養基。瓊脂培養基碾碎后置于10 ml離心管中加入5 ml二氯甲烷，振蕩1 min，超聲15 min。吸出二氯甲烷微孔過濾；重復提取1次，合并2次濾液；另取一支10 ml離心管加入2 ml濾液和2 ml水，振蕩1 min，3 000 r/min(離心半徑r=10 cm)離心5 min，棄去上層水相，再加入2 ml水，振蕩離心；準確吸取1 ml下層二氯甲烷于1.5 ml離心管中； 30 ℃，2 000 r/min(離心半徑r=10 cm)離心后放置過夜，完全揮發二氯甲烷。殘渣以500 μl 95%甲醇復溶，振蕩1 min，超聲15 min，14 000 r/min(離心半徑r=10 cm)離心5 min，取200 μl上清進樣分析。檢測設備為Agilent 6410型高效液相串聯質譜，色譜柱ZORBAX SB-C18 (3.5 μm，2.1 mm×100 mm)。色譜條件：洗脫梯度：甲醇與水(95∶5；V∶V)等度洗脫；流速：0.3 ml/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl；運行時間：3 min；retention time：1.29 min。質譜條件：離子源：電噴霧電離源； 極性：負離子模式；掃描方式：多反應監測；母離子：288.9；子離子：35；F值：40；CE值：8。

1.2.7 細胞毒性實驗 按照《GB/T 16886.12-2005 醫療器械生物學評價 第12部分：樣品制備與參照樣品》中的規定，對TSIS補片和SIS補片按照(2 cm×3 cm)/ml的比例制備浸提液，浸提介質為DMEM培養基，浸提條件為37 ℃，24 h。按照《GB/T 16886.5-2003 醫療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗》中規定的方法進行試驗。取對數生長期的L929細胞，調整細胞濃度至1×104/ml，100 μl/孔加至96孔板，37 ℃、5% CO2培養24 h。棄細胞培養上清，加入各組浸提液，每組6個復孔，置37 ℃、5% CO2培養72 h。加入MTT溶液處理4 h，450 nm波長下檢測OD值，以空白對照組為100%存活率，計算細胞存活率。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件包進行統計學處理，實驗數據以均值±標準差(x±s)表示。2組比較采用t檢驗，3組以上比較采用One-way ANOVA檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 最低抑菌濃度

從硝酸銀和苯扎溴銨的浮游菌和細菌生物膜最低抑菌濃度(MIC)實驗結果中可以看出，硝酸銀對革蘭氏陰性菌的抑制作用較好，而苯扎溴銨對革蘭氏陽性菌的抑制作用較好。但對生物膜狀態的細菌抑制效果較差。三氯生對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有較好的抑制作用，且在浮游菌和細菌生物膜狀態下均能產生明顯抑制作用，因此選擇三氯生制備抗菌生物補片。見表1。

表1 三氯生、硝酸銀和苯扎溴銨的最低抑菌濃度(μg/ml)

注：Sau為金黃色葡萄球菌，Sep為表皮葡萄球菌，Eco為大腸埃希菌，Pae為銅綠假單胞菌，Sma為嗜麥芽窄食單胞菌

2.2 體外抑菌性

TSIS對細菌的抑制作用良好，對大腸埃希菌(革蘭氏陰性菌)的抑制作用維持14 d，對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的抑制作用長達18 d。見表2和圖1。

表2 TSIS對不同時間Eco和San的抑菌圈實驗結果(mm，x±s，每組n=3)

注：與Eco 3 d比較aP<0.05；與San 7 d比較bP<0.05；與San 24 d比較cP<0.05。Eco為大腸埃希菌，San為金黃色葡萄球菌

圖1 體外抑菌圈實驗結果。TSIS對Sau處理1 d(A)和24 d(B)的抑菌圈，對Eco處理1 d(C)和7 d(D)的抑菌圈

2.3 三氯生體外釋放

體外釋放結果(圖2A)可以看出，TSIS補片第1～4天突釋(402.5±10.1) ng的三氯生，達到較好的早期抗菌效果。第5～14天三氯生釋放曲線逐漸平緩，起到較好的持續抗菌效果。見圖2。

2.4 細胞活性

TSIS的細胞毒性與未添加抗菌劑的SIS補片無顯著性差異(圖2B)，細胞存活率為(80.3±5.6)%。

注：aP<0.01，bP<0.001。TSIS為抗菌修補片，SIS為小腸黏膜下層脫細胞基質圖2 三氯生體外釋放曲線(A)和細胞活性結果(B)

3 討論

外科術后補片感染是較為嚴重的并發癥，通過預防給藥或術后給藥的方式并不能有效減少感染的發生[6]。生物補片的定義是指取自同種、異種的組織，經脫細胞處理去除組織中含有的各種細胞而完整保留細胞外基質的三維框架結構、能用于修復人體軟組織的材料，與合成補片相比，生物補片擁有生物相容性好、無過量瘢痕組織、無長期慢性炎癥、組織粘連輕等優點，是外科修補材料的發展趨勢[7]。生物補片具備一定的厚度、透濕性和孔隙率，可以作為抗菌成分的良好釋放載體，本研究以常用的生物補片原材料SIS為基礎，聯合抗菌劑制備出一種可以主動抗菌的新型生物修補片，體外抗菌性實驗和抗菌劑釋放實驗證實補片對研究菌株分別具備7 d和24 d的持續抑制作用，且細胞毒性較低。

本研究中選擇臨床常用的抗菌劑：三氯生、硝酸銀和苯扎溴銨，選擇肉湯稀釋法(浮游菌)抑菌實驗和生物膜形成實驗進行篩選。細菌生物膜是多數感染特別是與植入性材料相關的感染發生的誘因，生物膜一旦形成，即使使用千倍劑量的抗生素也難以去除[4]。但本研究發現，硝酸銀對革蘭氏陰性菌、苯扎溴銨對浮游狀態下的革蘭氏陽性菌抑菌效果較好，二者對細菌生物膜狀態下的革蘭氏陰性菌和陽性菌的抑制作用均較差。三氯生是一種廣譜抗菌劑，廣泛應用于日常精細化工品和抗菌縫線中，在一些生物補片研究中也取得了較好的抑菌效果[8-9]。Hernandez-Richter等[8]制備三氯生復合聚丙烯補片，對豬血管感染模型的治療效果良好；Berard等[9]發現三氯生復合至銀離子膠原補片可以顯著提升抑菌性，優化抑菌效果。三氯生的抑菌原理是吸附并穿透細菌細胞壁，對胞質中的脂質和蛋白質產生非特異性反應，造成不可逆變性從而殺死細菌[10]。既往報道深入研究發現三氯生可能存在靶向作用，靶點為脂肪酸合成途徑和酰基載體蛋白還原酶[11]。本研究中三氯生對臨床常見菌的浮游和生物膜狀態均產生良好的抑制作用，特別是對生物膜的MIC顯著低于硝酸銀和苯扎溴銨，因此本研究選擇三氯生為模式抗菌藥物。

三氯生的水溶性較低(約10 μg/ml)，單獨給藥容易聚集，降低抗菌活性[11]。因此本研究將三氯生完全溶解與乙醇溶液中制備儲備液，使其可以借助溶液充分、均勻的分散于SIS補片的多層結構間。補片植入后，借助SIS的超微三維網狀支架結構，富含粘滯成分，易于吸附的特點，以溶解、擴散作用減緩藥物釋放。因此，本研究制備的生物抗菌修補片TSIS可以有效、持續地抑制革蘭氏陰性菌和陽性菌的生長。以瓊脂平板為釋放介質，液質聯用分析生物抗菌修補片的三氯生釋放，發現其釋放曲線呈先突釋后平穩持續釋放的趨勢，這可能是由于補片內外形成三氯生濃度差，游離于補片內部的三氯生在可以短時間內迅速釋放，與抑菌圈實驗結果一致。

按照《GB/T 16886.5-2003 醫療器械生物學評價 第五部分：體外細胞毒性試驗》的評價方法，三氯生的加入使補片整體的毒性增加，但與未添加三氯生的SIS補片相比差異無統計學意義，TSIS補片和SIS補片的細胞活性均為Ⅰ級，符合植入型醫療器械的生物安全性要求。

本研究將抗菌劑三氯生與SIS生物補片結合，成功制備出生物抗菌修補片，并證實其具備廣譜、持久的抑菌性和生物安全性，為提升生物補片主動抗感染性的設計提供了新的思路。