拉曼光譜單細胞分選技術(shù)研究進展

閆帥帥， 郭 亮， 張聞桐， 李孟華， 劉 箐

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

作為生命中最小的功能單元，單個細胞是地球上所有生物的基本組成部分和進化的基本單位[1]。在看似相同的細胞群中，細胞個體性和差異性在生物學(xué)的許多關(guān)鍵領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[2]。充分了解單個細胞的異質(zhì)性是闡述細胞分化、癌癥的起源、微生物進化以及環(huán)境微生物群落功能等分子機制的基礎(chǔ)[3，4]。因此，研究單個細胞以了解異質(zhì)群體的復(fù)雜生物學(xué)并應(yīng)用于個性化醫(yī)療和耐藥細胞抗性等研究領(lǐng)域[5，6]。對單細胞進行無損、無標(biāo)記、準(zhǔn)確、高通量的分選是分析細胞間功能異質(zhì)性并探究自然界尚未培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵工具[7]。

傳統(tǒng)的間接細胞分選是基于外部基因編碼的熒光蛋白標(biāo)記或磁性分子和化合物標(biāo)記進行細胞的預(yù)分選，包括熒光激活細胞分選(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)和磁激活細胞分選(magnetically-activated cell sorting, MACS)，盡管它們都滿足高通量的需求，但是外加標(biāo)記或修飾可能會影響甚至改變細胞原本的狀態(tài)[8，9]。因此，開發(fā)無損、無標(biāo)記的功能性細胞分選的高通量技術(shù)是發(fā)展單細胞分析科學(xué)的必要條件[10]。拉曼光譜技術(shù)作為一種無標(biāo)記的生化指紋技術(shù)，能夠揭示單個細胞的內(nèi)在化學(xué)信息，對單細胞研究具有很大的潛力[11，12]。此外，拉曼光譜與單細胞操作技術(shù)(包括液體溶液中的微流控、微液滴、光鑷技術(shù)以及芯片上的激光噴射技術(shù))相結(jié)合，可以實現(xiàn)對目標(biāo)細胞的分選，即拉曼激活細胞分選技術(shù)(Raman-activated cell sorting, RACS)[13-16]。

1 單細胞拉曼光譜(Single-cell Raman spectra, SCRS)

在過去的大約15年中，拉曼光譜已成為一種成熟的分析工具，可用于無損、快速地表征和鑒定單個細胞[17]。拉曼散射由光與分子的非彈性相互作用產(chǎn)生，光譜信號對應(yīng)于化學(xué)鍵的振動，其依靠激發(fā)光的非彈性散射和分子共振可以對單個細胞產(chǎn)生獨特“指紋圖譜”[18，19]。因為SCRS本質(zhì)上是分子振動的集合，其通常包含1000多個拉曼譜帶代表核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)等分類學(xué)標(biāo)記的不同振動模式，體現(xiàn)了單個細胞豐富而復(fù)雜的固有信息，反映了細胞的基因表達、特定化合物的生物合成、細胞成分、特征結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)和代謝狀況等[20-22]。HANSON等[23]通過SCRS將置于不同營養(yǎng)環(huán)境和生長階段的分支桿菌進行了區(qū)分和鑒定。HO等[24]對30株臨床病原菌的單層細胞僅采集1 s的時間，通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法對不同菌株進行了區(qū)分和鑒定，達到了82%的準(zhǔn)確率，并成功應(yīng)用于相關(guān)臨床癥狀患者。此外，細胞中具有強拉曼響應(yīng)的特征物質(zhì)對靶細胞的表型表征至關(guān)重要，SONG等[25]基于類胡蘿卜素獨特的拉曼特征譜帶將海水樣品中光養(yǎng)細菌進行分類，GUO等[26]通過D2O同位素標(biāo)記鑒定了飲用水中的不可培養(yǎng)細菌的代謝活性。GERMOND等[27]通過SCRS將大腸桿菌耐受和不耐受β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類等抗生素的細菌進行了區(qū)分，并進行相關(guān)基因型的分析，將單細胞表型和基因型相聯(lián)系。

2 液體中的單細胞拉曼分選

2.1 基于通道微流體技術(shù)的拉曼單細胞分選

將傳統(tǒng)的SCRS技術(shù)與通道微流體系統(tǒng)相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)單細胞的計數(shù)和分選，并維持靶細胞活力。通道微流體系統(tǒng)是由軟光刻技術(shù)修飾的聚二甲基硅氧烷(PDMS)與玻璃組件相粘連形成多層、多通道的納米級微管、腔室和閥門組成[28，29]。通過施加壓力使微流體獲得流體動力，以一定的流速來控制細胞樣品量，經(jīng)過下游的單細胞拉曼特異性檢測，利用滯留力(機械力、光學(xué)、磁力、介電泳等)對靶細胞進行捕獲[30]。例如，LI等[31]基于特異性類胡蘿卜素拉曼譜帶信號強的優(yōu)勢，在微流體系統(tǒng)中對C12和C13標(biāo)記的藍細菌細胞進行計數(shù)。針對單細胞自發(fā)拉曼信號弱的劣勢，NOLAN等[32]將金屬納米粒子多重SERS標(biāo)簽與抗體或靶標(biāo)分子相偶聯(lián)，在微流體系統(tǒng)中特異性的捕獲靶細胞，通過SERS納米標(biāo)簽產(chǎn)生強而窄拉曼信號，從而實現(xiàn)對靶細胞的多參數(shù)單細胞群體分析。

介電電泳(Dielectrophoresis, DEP)是在非均勻電場中由極化效應(yīng)引起的中性物質(zhì)的平移運動，可以直接在流體中捕獲微米級、納米級的微粒，實現(xiàn)對靶細胞的捕獲[33]。在SCHR?DER等研究中，通過DEP可以在幾分鐘內(nèi)將懸浮液中大腸桿菌和糞腸球菌進行分離和捕獲，并結(jié)合SCRS和多元統(tǒng)計分析實現(xiàn)對尿路感染患者的病原微生物分類[34]。CHRIMES等[35]首創(chuàng)的微流體-SERS-DEP系統(tǒng)對單個酵母細胞在不同生長階段所分泌的化學(xué)物質(zhì)進行了原位動態(tài)檢測。利用SERS信號的強度對基于DEP固定在微流體環(huán)境中的細胞進行化學(xué)監(jiān)測，從而分析酵母細胞的代謝、增殖、凋亡以及細胞之間的化學(xué)傳遞。ZHANG等[36]開發(fā)了一種間歇排序的RACS微流控系統(tǒng)，通過施加周期性的正介電電泳(positive DEP, pDEP)場，實現(xiàn)對單細胞的捕獲、排序并分別定位到用于拉曼測量的檢測點，并結(jié)合電磁閥吸氣的開關(guān)以進行細胞分離，并成功用于基于類胡蘿卜素譜帶的酵母細胞的亞秒級分選。使得在高速流微流體中通過拉曼識別單個細胞和自動分選成為可能。

當(dāng)基于外在的“滯留力”對單個細胞進行捕獲或固定化時，可能會影響細胞原有的生理狀態(tài)，對檢測、分析細胞群體異質(zhì)性造成影響。MCLLVENNA等[37]開發(fā)無需靶細胞捕獲的拉曼微流控系統(tǒng)，其中的微流體壓力分配器基于內(nèi)在拉曼信號對單個細胞進行連續(xù)和自動分選。其中根據(jù)C12或C13標(biāo)記的藍細菌中的特異性類胡蘿卜素拉曼譜帶在2 s內(nèi)實現(xiàn)了單個細胞的拉曼光譜測量和分選。ZHANG等[38]建立的32通道多重受激拉曼散射流式細胞系統(tǒng)，在3 s內(nèi)將約400分化的和1 300個未分化的3T3-L1細胞進行分類和鑒定。

2.2 基于液滴微流體技術(shù)的拉曼單細胞分選

液滴微流體技術(shù)是微流控技術(shù)的重要分支，它利用水和油的不相溶性來制造微升或納升級液滴微反應(yīng)器，簡單、快速的實現(xiàn)對懸浮液中的單個細胞進行封裝[39，40]。微液滴基于其直徑的可控性、對單細胞封裝的便捷性、避免交叉感染的微反應(yīng)器等優(yōu)勢，使其成為的理想高通量單細胞分析技術(shù)[41]。

KIM等[42]將拉曼光譜、PDMS與微液滴系統(tǒng)偶聯(lián)，用微液滴包裹萊茵衣藻細胞，原位表征了其脂質(zhì)隨時間的變化。但是，微液滴凹凸表面和油性介質(zhì)可能對靶細胞的拉曼信號產(chǎn)生影響。WANG等[43]開發(fā)的拉曼激活液滴分選系統(tǒng)(Raman-activated droplet sorting，RADS)針對上述缺陷進行了改進，在液滴產(chǎn)生之前就對靶細胞進行SCRS檢測，其主要對不同蝦青素產(chǎn)能的單細胞綠藻進行了分選和鑒定。首先將細胞懸液加載到芯片為通道中，在兩個夾流的作用下使其形成單細胞流，當(dāng)細胞通過激光點時獲得SCRS，然后用微液滴將單個細胞進行封裝，經(jīng)過特定的延遲后，含有靶細胞的液滴通過DEP進行分選并流入收集通道，而非目標(biāo)液滴將流入廢物通道。并且此系統(tǒng)的通量為每分鐘分選260個細胞，且可以維持分選靶細胞的活性。

XU等將微液滴系統(tǒng)與SERS相結(jié)合對不同癌癥細胞代謝異質(zhì)性進行了分析。研究了癌細胞系(HepG2和BNL.CL2)中堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，API)的表達，將細胞懸液、BCIP(API的催化底物)和金納米顆粒共孵育后作為整體被包裹于微液滴中，將其置于三個平行通道的微芯片中，對產(chǎn)生的共振拉曼活性物質(zhì)BCI(API的催化產(chǎn)物)進行SERS檢測[44]。此外，還建立了一種高通量、雙通道、基于SERS的等離子體微滴平臺用于檢測癌細胞系(MCF-7，HepG2，SGC和BNL.CL2)表面的唾液酸，并且在單細胞水平上成功的區(qū)分了不同癌細胞系。因此微液滴系統(tǒng)不僅可以分選單個靶細胞直接用于分類和鑒定，還可以通過分選靶細胞來間接研究相關(guān)代謝活性物質(zhì)，有利于全面研究細胞群體的異質(zhì)性和復(fù)雜性[45]。在藥物醫(yī)學(xué)，癌癥診斷和單細胞遺傳分析等臨床應(yīng)用中具有潛在的價值。

2.3 基于光鑷技術(shù)的拉曼單細胞分選

高度聚焦的激光束形成的光學(xué)鑷子提供非接觸式捕獲力來物理固定和移動溶液中的單個細胞，同時，激光束作為激發(fā)源以生成靶細胞的拉曼指紋圖譜用于分類或鑒定[46]。近年來，這種高通量、無標(biāo)記的拉曼光譜與光鑷技術(shù)相結(jié)合，用于研究微通道中的單個細胞已經(jīng)取得了很大的進展。

在早期拉曼光鑷技術(shù)用于單細胞分析時，通常是光鑷捕獲、固定細胞后，人工進行輔助操作，將靶細胞移至收集區(qū)域。XIE等[47]利用拉曼光鑷技術(shù)將有活性和無活性的酵母細胞選擇性的分類到不同的收集區(qū)域，并進行驗證。HUANG等[48]利用拉曼光鑷技術(shù)識別毛細管中的目標(biāo)細胞，然后手動將單細胞移至毛細管一端，進行下游分析。隨著高通量、自動化要求越來越高，更加符合單細胞分選條件的拉曼光鑷的技術(shù)平臺被逐步開發(fā)和完善。LAU等[49]將多通道微流體設(shè)備和激光鑷子拉曼光譜相結(jié)合，集成的RACS自動化平臺直接將細胞遞送至激光阱拉曼系統(tǒng)并基于其拉曼特征對細胞進行分選，并成功用于識別和分類兩種白血病細胞系，但是每個光譜采集時間需要120 s，耗時較高。DOCHOW等[50]將上述分選系統(tǒng)進行改進，僅用10 s就可以對單細胞進行光譜采集、捕獲和收集，大大提高了分選的速率，并且可以用線性判別分析對五種細胞進行分類和識別。FANG等[51]設(shè)計了一個葫蘆狀的微通道分選芯片，與拉曼光鑷相結(jié)合可以同時獲得一個獨立的單個細胞及其拉曼光譜，對四種不同細胞進行了精確的單細胞分離，但是每次細胞分離需要3 min，分選速度收到了極大的限制。為了研究多種細菌群落的復(fù)雜性和異質(zhì)性，LEE等[52]建立了一個基于同位素標(biāo)記對活細胞進行分類的拉曼光鑷的自動化光流體平臺，此方法與前人研究最大的區(qū)別是不受限于包含強拉曼相應(yīng)的標(biāo)志物的影響，適用于廣泛的單細胞分選。通過對四種模型細菌的分選，在高精度的提前下，每分鐘可以分選3.3～3.8個細胞。雖然，拉曼光鑷與微流控結(jié)合大大提高了單細胞的分選精度，但是需要進一步的創(chuàng)新以實現(xiàn)更高的細胞分選率。

3 基于玻片的拉曼單細胞分選

對于復(fù)雜的自然界微生物群體在單細胞水平進行異質(zhì)性分析時，最好保持其原始的環(huán)境和狀態(tài)。此外，許多微生物存在于土壤、糞便、生物膜等復(fù)雜固體介質(zhì)中，不適用于微液體相關(guān)的RACS技術(shù)進行分析[53]。因此，利用拉曼激活細胞彈射(Raman-activated cell ejection, RACE)技術(shù)能夠?qū)Ω信d趣的單細胞進行原位分選[54]。

RACE的概念在2013年第一次被提出，目標(biāo)細胞置于涂有CaF2的載玻片上進行SCRS的采集，然后用激光誘導(dǎo)正向轉(zhuǎn)移技術(shù)從玻片上對靶細胞進行分離[16]。但是此系統(tǒng)由個模塊配合完成，并且通過高功率激光的作用，會對單細胞造成損傷，不利于下游的測序分析。因此，SONG等[25]開發(fā)了一套多合一的RACE系統(tǒng)，在玻片上涂無拉曼信號Al層對目標(biāo)細胞進行SCRS采集，記錄靶細胞位置，將玻片翻轉(zhuǎn)后再進行單細胞分選，通過基于類胡蘿卜素拉曼信號作為生物標(biāo)記物成功鑒定了紅海樣品中的潛在光養(yǎng)細菌，并推測了相關(guān)基因型。但是，所使用的玻片在翻轉(zhuǎn)過程中可能造成污染，對下游的全基因組擴增和測序造成影響。JING等[55]基于上述劣勢，將涂有銦錫氧化物的透明的石英分選芯片與收集裝置合二為一，更完善了RACE的分選模塊，通過對中國黃海中光合細菌的同位素標(biāo)記和靶細胞的RACE，并結(jié)合下游測序重新編碼了兩個關(guān)鍵細菌CO2固定代謝途徑的近乎完整的基因組。WANG等[56,57]在前人研究的基礎(chǔ)上，利用RACE系統(tǒng)對人類腸道菌群中功能性細菌的相關(guān)代謝途徑和耐藥性等進行了表型和基因型的分析。然而，RACE系統(tǒng)分選的細胞大多不具有細胞活性，達不到對原位分選的單細胞進行培養(yǎng)的需求。

4 總結(jié)與展望

在過去十年中，已經(jīng)開發(fā)了許多越來越準(zhǔn)確、快速、智能化的RACS集成技術(shù)用于分析單個細胞。RACS作為一種無標(biāo)簽的單細胞分選技術(shù)，為了解同基因細胞群體中的表型異質(zhì)性和探索復(fù)雜細胞群體中的單細胞功能提供了新的研究方法，開辟一個新的細胞生物學(xué)的領(lǐng)域。盡管，現(xiàn)階段對于單個細胞分選已達到了很高的準(zhǔn)確率，但是自動化的分選速率還有待提高，這依賴于RACS與更精密的拉曼光譜儀、更先進的SERS技術(shù)相集成。更普適的RACS有望在未來適合所有環(huán)境樣本的單細胞分析，對群體中細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及表型和基因型的聯(lián)系有更好的解釋，對于精準(zhǔn)醫(yī)療和探索環(huán)境不可培養(yǎng)微生物意義重大。