光催化材料及制品抗真菌性能測試方法的研究

王青柏, 彭如群, 肖惠敏, 劉靜霞, 周少璐, 謝小保

廣東省微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心， 廣東省科學院，華南應用微生物國家重點實驗室，廣州 510070

光催化材料及制品因其在光照射激發條件下產生催化作用，發生氧化還原反應，可以長期有效地分解有機污染物和部分無機污染物，具有廣譜抗菌、除臭、防污、分解空氣及水中有機污染物、自潔、可重復利用等特點，展示其在環境治理、功能建材等方面的巨大應用前景[1-3]。目前研究較多的光催化材料有TiO2，ZnO，Cds，WO3，Fe2O3等，其中TiO2氧化活性較高，化學穩定性好，對人體無毒害，成本低，無污染，應用范圍廣，因而最受重視，是目前應用最廣泛的納米光催化材料，也是最具有開發前途的綠色環保型材料。TiO2目前廣泛應用于光催化空氣凈化、光催化抗菌、防污自動清潔、大氣污染治理、水處理等，如用于陶瓷，玻璃，混凝土，塑料，涂層、紙張等功能產品的生產[4,5]。

然而，光催化材料及制品的抗真菌效果沒有標準化的測試和評價方法。本項目的研究，為建立符合我國環境條件和實際應用的紫外光響應的光催化材料及制品抗真菌活性測試方法及評價標準提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器和試劑

生化培養箱、馬鈴薯瓊脂(PDA)培養基、沙氏瓊脂培養基，購自廣州環凱微生物科技有限公司。

1.1.2實驗菌株

標準菌株：黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC 3.5487、嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)CGMCC 3.8028、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231，均購自廣東省微生物菌種保藏中心，由本實驗室保存。

1.1.3樣品

共收集10個光催化樣品，從光催化制品或材料上選取平整部分，切成邊長為50 mm±2 mm方塊，制備6片試樣，3片用于光照條件下測試，3片用于暗條件下測試。

采用石英玻璃片作為空白對照樣，將空白對照樣切成邊長為50 mm ±2 mm方塊(厚度小于10 mm)，制備9個空白對照樣片，其中3片用于0時間洗脫，3片用于光照測試，3片用于暗條件測試。

1.2 實驗方法

1.2.1試驗菌液的制備

將黑曲霉和嗜松青霉分別接種在PDA培養基上28 ℃±1 ℃培養4 d～7 d，形成良好的孢子培養物后使用；將白色念珠菌接種在沙氏瓊脂培養基上36 ℃±1 ℃培養1 d后使用。

取10 mL的稀釋液倒入真菌培養物中，用接種環輕輕的刮取真菌及孢子，通過消毒棉或雙層紗布過濾，然后將濾液用吸管或渦旋混合器混勻。在顯微鏡下用血球計數板或比濁法測試得到的真菌濃度，并稀釋至(2.0～5.0)×105CFU/mL的濃度。

制備好暫時不用的真菌懸液可在冰箱中(5 ℃～10 ℃)存儲，霉菌孢子懸液在冰箱中存儲時間不超過24 h，白色念珠菌懸液不超過4 h。

1.2.2接種培養

將空白對照樣片和光催化樣片分別放入潔凈的培養皿中，試驗面朝上。用移液管吸取0.2 mL的1.2.1制備的菌液，滴加到每個試樣的表面，然后用聚乙烯薄膜(40 mm×40 mm)覆蓋。調節薄膜使菌液在樣片和薄膜之間分散均勻。注意不要將菌液溢出。

1.2.3培養皿中樣片的放置

保濕濾紙鋪在培養皿的底部，用適量的無菌水(5 mL～10 mL)浸泡濾紙，然后將玻璃棒置于濾紙上面。將已接種的樣片和薄膜小心放在玻璃棒上，用玻璃板蓋住培養皿。除了帶有薄膜的樣片外，所有培養皿里的用品都應經過高壓蒸汽滅菌。

1.2.4光照培養

打開光源，穩定30 min，然后調節燈管位置或功率調節光照強度。將需要光照的接種樣片(3片光催化樣片，3片空白對照樣片)置于0.4 mW/cm2～0.8 mW/cm2的紫外光照射培養38 h ±2 h，控制溫度在25 ℃±2 ℃，相對濕度不低于85%。

將3個光催化樣片、3個空白對照樣片置于暗條件下，暗條件的培養溫度控制在25 ℃±2 ℃，相對濕度不低于85%，持續培養時間等同光照條件。

2 結果與討論

2.1 光源

國際上紫外光光響應的光催化產品使用波長一般使用351 nm和365 nm熒光作為激發光源[6]，用對照樣片測試波長對真菌孢子或細胞的影響，結果見表1。

表1 紫外波長對真菌孢子或細胞的影響

從表1結果可以看出，351 nm和365 nm熒光對測試菌沒有影響，說明365 nm熒光既可以激發光催化材料的催化抗菌活性而本身沒有殺菌性能，參考國家標準“GB/T 23763—2009光催化抗菌材料及制品 抗菌性能的評價”[7]，本標準選擇365 nm熒光作為紫外光源。

2.2 光照強度

本實驗測試了光照強度對真菌孢子或細胞的影響，結果見表2。

表2 光照強度對真菌孢子或細胞的影響

從表2結果可以看出，0.4 mW/cm2和0.8 mW/cm2光照強度對測試菌沒有影響，本標準選擇0.4 mW/cm2至0.8 mW/cm2作為紫外光光照強度進行試驗。

2.3 光照時間

光照強度采用0.8 mW/cm2，光照處理時間對抗真菌試驗結果的影響，結果見表3。

表3結果顯示光照24 h抗真菌結果較差，光催化材料的抗真菌活性還沒有充分發揮作用，光照48 h測試結果都具有抗菌效果，但樣品間的結果區分度差，而光照38 h測試結果的區分度較好，測試結果也穩定。因此，光照時間采用38 h最合適。

2.4 方法驗證

2.4.1檢測人員比對試驗

根據確定的試驗方法進行了檢測人員比對試驗，以考核實驗方法的重復性，檢測結果表明不同的檢測人員對同一樣品測試結果的重復性較好。人員比對測試結果見表4。

表3 光照時間對真菌孢子或細胞的影響

表4 不同檢測人員的比對試驗

2.4.2實驗室比對試驗

同時依據本標準方法，廣東省微生物研究所和中科院理化所抗菌檢測中心兩個不同實驗室，使用不同儀器進行了比對試驗，比對結果表明(表5)，2個實驗室測試的重現性較好，結果相差在誤差范圍內(微生物的實驗誤差在15%以內)，試驗方法的再現性好，符合微生物抗菌實驗的相關要求。

3 結論

本研究以黑曲霉、嗜松青霉、白色念珠菌為測試菌種，真菌細胞或孢子濃度濃度為(2.0～5.0)×105CFU/mL條件下，確定了波長365 nm、輻照強度0.4 mW/cm2至0.8 mW/cm2、光照孵育時間38 h為光催化材料及制品抗真菌性能測試的最佳條件，并對試驗條件進行了驗證，結果表明本實驗方法重復性和再現性良好，為國家標準“GB/T37247—2018光催化材料及制品抗真菌性能測試方法及評價”[8]的制定提供技術了科學依據。

表5 實驗室間比對試驗