高蛋白酵母水解物生產菌株的篩選研究

徐智鵬， 陳毛清 ， 曹詩國， 梁大煒，熊 鋒 ，戴晉軍 ， 胡駿鵬 *

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443000；2.安琪酵母（崇左）有限公司，廣西崇左532201）

隨著我國畜牧、水產業的快速發展，飼料的需要量越來越大，致使飼料特別是飼料蛋白源的供求矛盾日益突出。魚粉作為飼料行業最常用的蛋白原料，由于對其需求量增加，而全球魚粉資源逐漸減少，因而價格居高不下（周岐存等，2005）。動物源蛋白原料一直以來是飼料配方中常用組分，隨著行業對食品安全認識的加深，動物源蛋白原料如血漿蛋白粉可能存在攜帶病原菌的安全隱患（汪洋等，2014）。針對蛋白資源對外高度依賴、原料價格無序波動、動物性原料存在生物安全性等問題，開發新型飼用蛋白資源是飼料工業全面均衡可持續發展的剛性需求。

酵母水解物是以釀酒酵母為菌種，經液體發酵得到的菌體，再經自溶或外源酶催化水解后，濃縮或干燥獲得的產品（中國農業部，2014）。已有研究表明，酵母水解物可滿足畜禽、水產和反芻等養殖動物對蛋白原料營養的需求，是一種有效的飼用蛋白源（董愛華等，2017；賀淼等，2015）。酵母水解物對動物有極佳的誘食、免疫和促生長功效，對促進養殖動物健康發育具有重要意義（陳星河等，2016；孫雪梅等，2016）。

酵母含有豐富的蛋白質、RNA、氨基酸、維生素等成分，但是不同酵母所含的營養成分存在一定的差異性（俞燦等，2017；陳文明等，2015）。本文通過對多株酵母菌種進行篩選研究，以期獲得一株蛋白質含量高、生長性能優良、有較高的糖蜜轉化率和氮源利用效率的酵母菌種，為高蛋白酵母水解物的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 酵母菌株 酵母菌株由安琪酵母股份有限公司菌種庫保存，均屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌種屬。

1.2 培養基 液體搖瓶基礎培養基：蔗糖10%，酵母粉 2%，硫酸鎂 0.1%，磷酸二氫鉀 0.1%，pH（5.0±0.2）。1.3 檢測方法

1.3.1 酵母濕重測定 吸取10 mL酵母發酵液置于烘干去皮的離心管中，5000 r/min離心10 min，棄上清，稱重計算酵母濕重（g/L）。

1.3.2 蛋白質測定 采用GBT 6432-94飼料中粗蛋白質測定方法。

1.3.3 酒精測定 重鉻酸鉀比色法碘量法測定酒精含量（陳詩枚，2000）。

1.3.4 酵母乳產量計算 吸取10 mL酵母發酵液置于烘干去皮的離心管中，5000 r/min離心10 min，棄上清，洗滌2～3次，采用烘箱測定干物質含量。發酵總產量（折干）為收獲酵母總濕重與干物質的乘積。

1.3.5 糖蜜轉化率計算 酵母產量除以與糖蜜理論轉化酵母產量。

1.3.6 氮源轉化率計算 實際酵母總含氮量除以添加氮總量。

1.3.7 色度測定 色度采用色采色差儀進行測定（CR-400，日本柯尼卡美能達）。

1.4 搖瓶發酵初篩

1.4.1 菌種的純化與活化 將菌種庫里凍干管保存的酵母菌種取出，采用直接劃線法，用接種環蘸取保種液在固體培養皿上進行劃線培養，篩選單菌落。挑取表面平滑的單菌落菌種接種于裝有250 mL基礎培養基的三角燒瓶中，置搖床上培養，轉速 180 r/min，30℃培養24 h。

1.4.2 菌體蛋白質測定 將活化的酵母菌種按照1‰的接種量接種到裝有1 L基礎培養基的三角燒瓶中，置搖床上培養，轉速180 r/min，30℃培養20 h，收集培養液抽濾餅，測定酵母濾餅干物質含量，并檢測蛋白質含量，獲得2株蛋白質含量相對較高的酵母菌種。

1.5 二級發酵篩選培養

1.5.1 搖瓶發酵菌種培養 將活化的酵母菌種按照1‰的接種量接種到裝有2 L基礎培養基的三角燒瓶中，置搖床上培養，轉速180 r/min，30℃培養24 h。靜置4℃過夜取上清接種50 L發酵罐放大培養。

1.5.2 50 L種子罐發酵培養 50 L種子罐發酵底水18 L，121℃滅菌30 min。發酵過程中采用流加培養方式，氮源為硫酸銨，碳源為糖蜜（總糖濃度約30%），體積約18 L，發酵過程采用濃度為20%的純堿調控pH。接種2 L搖瓶培養液，控制發酵酒精0.1%左右，總糖濃度0.01%～0.5%，發酵溫度維持30℃，發酵通氣量控制為8～40 m3/h，發酵攪拌速度控制為150～450 r/min，當濕重達到160 g/L時選擇放罐。收集酵母乳作為30 L發酵罐的種子，可以供3～4次30 L發酵罐接種使用。

1.5.3 30 L發酵罐發酵培養 30 L發酵罐底水7.5 L，121℃滅菌30 min。發酵過程采用流加培養方式培養，氮源為氨水，碳源為糖蜜（總糖濃度約30%），體積約10 L，發酵過程采用濃度為10%的濃硫酸調控pH。接種酵母乳，發酵起始濕重為55 g/L左右，發酵過程控制發酵酒精0.1%左右，發酵溫度維持30℃，發酵通氣量控制為20～45 m3/h，發酵攪拌速度控制為200～600 r/min，當發酵時間14 h時放罐，收集發酵液。

1.5.4 酵母乳收集及酵母水解物制備 將收集的發酵液采用連續流分離機進行分析，收集酵母乳沉淀重懸洗滌，至酵母乳色度為50～55。

1.6 酵母水解物生產制備 將收集的酵母乳采用快速水分測定儀測定干物質含量，控制干物質為15%～20%，添加3%～5%的檸檬酸后調節溫度為51.5～55.0℃，自溶8～12 h后升溫至55～60℃，調節pH至5.5～6.0，加入2‰ ～4‰的AH-1酶制劑酶解，酶解6～12 h后，升溫75℃保溫1 h。采用噴霧干燥的方式對樣品進行干燥，噴塔進風溫度為165℃，出風溫度為90℃，收集粉體樣品進行結果分析。

1.7 酵母水解物口感評價 酵母水解物口感評價方法參照周俊清等（2008）方法，感官評定小組由經過篩選的9人組成（男女比例4：5，均為不吸煙者），樣品用熱水溶解配制成2%的水溶液。評定員用蒸餾水漱口后，取出2 mL樣品液置于口中，5～10 s后吐出，然后根據評分表進行評分（表1），評分高的為口感較優的樣品。

表1 酵母水解物口感評分表

2 結果與分析

2.1 高蛋白菌株的搖瓶發酵篩選 對多株酵母菌株搖瓶培養后，菌株蛋白質檢測結果如圖1所示。數據表明，菌株 1、2、3、4、5、6 的蛋白質含量均高于對照菌株，且含量達到58%以上；菌株1、菌株2的蛋白質含量超過60%，明顯優于對照菌株，因此篩選菌株1和2進行二級發酵培養研究。

2.2 二級發酵篩選培養

2.2.1 50 L發酵罐培養 相同發酵條件下，酵母菌株最終發酵濕重與發酵過程中生產酒精的曲線如圖2所示。整個發酵過程中，菌株1最終發酵濕重為186 g/L，高于對照菌株（166 g/L）；發酵第16小時，菌株1的酒精含量低于0.1%。上述結果表明菌株1對酒精的消化速度遠遠優于對照菌株和菌株2。

發酵結束，收集酵母乳進行蛋白質含量的測定，計算酵母乳產量、糖蜜轉化率及氮源利用率，結果見表2。在相同發酵條件下，不同酵母菌株對糖蜜的轉化率和氮源的利用率均不相同，菌株1的蛋白質含量、糖蜜轉化率及氮源利用率都高于對照菌株和菌株2。

表2 不同酵母菌株的生產過程數據比較（50 L種子罐）%

2.2.2 30 L發酵罐培養 統一發酵工藝條件，將前期50 L發酵罐發酵收集的酵母乳作為種子進行30 L發酵罐發酵，整個發酵過程控制同50 L發酵罐發酵過程，控制發酵時間14 h后取樣分析，最終發酵濕重與發酵過程中生產酒精的曲線如圖3所示。整個發酵過程中，菌株1最終發酵濕重為246 g/L，高于對照菌株（237 g/L）和菌株 2（225 g/L）。數據表明，3株酵母菌株在30 L發酵過程中，酒精含量均能控制在較低水平。

發酵結束，收集酵母乳進行蛋白質含量的測定，計算酵母乳產量、糖蜜轉化率及氮源利用率，結果見表3。在相同發酵工藝、營養源添加的條件下，不同酵母菌株對糖蜜的轉化率和氮源的利用率不相同，其中菌株1在蛋白質含量、糖蜜轉化率和氮源利用率上都表現出優勢，與50 L發酵罐結果保持一致。

表3 不同酵母菌株的生產過程數據比較（30 L發酵罐）%

2.3 酵母水解物制備 收集30 L發酵罐培養的酵母乳，經洗滌后，采用相同酶解工藝制備得到3種酵母水解物，指標如表4所示。數據表明，酵母水解物的營養成分指標 （粗蛋白質、賴氨酸和RNA含量）由酵母乳決定，生產技術指標（酸溶蛋白與氨基酸態氮含量）由酶解工藝決定；3種酵母乳均可以制備酵母水解物；3種酵母水解物的RNA、酸溶蛋白和氨基酸態氮含量無明顯差異，但菌種1在蛋白質和賴氨酸上有明顯優勢。

2.4 酵母水解物口感測試 不同菌種生產酵母水解物感官評價結果如表5所示。數據表明，3種酵母水解物屬于同一口感系列，菌株1生產的酵母水解物鮮甜味濃郁、回味好、整體口感均衡；對照菌株生產酵母水解物鮮甜味濃郁、有回味、整體口感略差于菌株1生產酵母水解物；菌株2生產酵母水解物鮮甜味適中，回味及整體口感偏淡。

表4 不同酵母水解物的生產指標和營養成分%

表5 不同酵母水解物的口感評分結果

3 結論

酵母水解物富含蛋白質、氨基酸、小肽、核酸等營養成分，其對養殖動物的促生長作用已被證實。本文從酵母菌種出發，通過搖瓶篩選、二級發酵篩選培養（50 L種子罐和30 L發酵罐）、酵母水解物制備、感官評價等方法研究，表明菌株1的發酵過程數據（酒精消耗、糖蜜轉化率、氮源利用率等）和營養成分（蛋白質、賴氨酸含量）均優于對照菌株和菌株2，可作為生產高蛋白酵母水解物（蛋白質≥55%）的生產菌株。后續需對該菌株的發酵工藝進一步系統優化，以期逐步實現該菌株的發酵工藝放大及高蛋白酵母水解物的規模化生產。