絲素基雙層敷料的制備及其性能

鐘紅榮， 方 艷， 包 紅， 吳婷芳， 張小寧， 徐 水， 朱 勇

(西南大學 生物技術學院， 重慶 400715)

皮膚是人體最大的器官，也是防御外界刺激的第1道屏障[1]。由創傷、擦傷、皮膚潰爛和燒傷等原因引起的皮膚損傷易造成細菌感染、體液流失并引發多種并發癥[2]，嚴重威脅到人類的生命與健康。通常采用傷口敷料對其進行保護，以防傷口感染和脫水，并為傷口修復提供濕性愈合環境。

目前的傷口敷料有膜、凝膠、海綿以及納米纖維等類型。針對有表面滲出液的傷口或全層皮膚損傷修復，海綿型材料多孔的結構有利于提高水蒸氣透過率，具有良好的吸附、吸收和止血作用，成為最優的選擇[1]。絲素蛋白(SF)擁有生物相容性好、可降解、炎癥反應小、透氧性能好、易化學修飾等優點，但由于大量非極性氨基酸的存在限制了其吸濕保濕性能，因此，單一的絲素基敷料遠遠不能滿足創口愈合的需要。葡萄糖(Glu)作為性價比較高的親水性小分子物質，可用來彌補絲素蛋白的這一缺陷。Baimark等[3]最早在絲素蛋白溶液中添加葡萄糖采用蒸發溶劑法制備了絲素/葡萄糖薄膜。Srivastava等[4]進一步研究表明，絲素/葡萄糖薄膜有利于L929成纖細胞的黏附和增殖。隨后基于不同品種蠶絲的絲素蛋白結構與性能的差異化，Srivastava等[5]分別用葡萄糖對琥珀蠶和印度柞蠶的絲素蛋白進行增塑修飾發現，葡萄糖均能提高這2種絲素膜的力學性能和表面粗糙度。Panico等[6]也以絲素為基材，添加葡萄糖制備了共混膜，體外生物降解實驗證明該膜穩定性好。

聚氨酯(PU)憑借其優良特性，成為醫用敷料領域發展最為迅速的一種高分子合成材料。文獻[7-8]分別制備了由3個不同層組成的敷料，其中均以透明的聚氨酯薄膜作為防水透氣層，證明了該敷料能提供有利于傷口愈合的微濕環境，因此，以聚氨酯為原料的薄膜不僅允許水蒸氣透過，隔絕液態水，使傷者復原期間能淋浴，而且其致密的膜結構也能有效阻止細菌等微生物的侵入和傷害，該薄膜兼具防水透氣及阻菌的功能。

基于以上對絲素蛋白、葡萄糖和聚氨酯在醫用敷料方面的研究，證明了絲素蛋白作為優良的基材可應用于傷口敷料的開發，但其不能完全滿足理想型傷口敷料的需求，如力學性能不足、吸水能力有限等。近年來葡萄糖在敷料方面作為親水性成分及增塑劑的研究引起關注，因此，本文結合二者的優點，制備了一種新型的雙層敷料：底層為采取冷凍干燥法制備的多孔性海綿，適用于滲出液較多的傷口；表層為采取蒸發溶劑法制備的聚氨酯薄膜，既可避免環境微生物入侵傷口，又可克服單一海綿材料水分揮發過快的缺點。雙層敷料的設計可為開發理想的臨床用傷口敷料提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

材料：蠶繭，西南大學生物技術學院纖維材料實驗室；葡萄糖粉末、甘油(Gly)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，成都科龍公司；聚氨酯，德國拜爾公司；胎牛血清、高糖DMEM培養基、苯酚，北京索萊寶科技有限公司；醫用級聚烯烴熱熔膠，東莞市銘遠塑膠有限公司。

儀器：Modulyo-d型臺式冷凍干燥機，賽默飛世爾科技公司；RXZ-200C型人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司；HH-8型數顯式恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器有限公司；CTM2100型微機控制電子萬能材料試驗機，上海協強儀器制造有限公司；JSM-6510LV 型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；Varian 640型傅里葉紅外光譜儀，美國Varian公司；MAXima_X XRD-7000型X射線衍射儀，日本島津公司；HSC-1型差示掃描量熱儀，北京恒久科學儀器廠；B13-3型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 試樣的制備

1.2.1 絲素/葡萄糖海綿的制備

首先將蠶繭按照常規方法[9]處理制備成質量分數為4%的絲素蛋白溶液，然后向絲素蛋白溶液中加入不同質量分數(0、5%、10%、15%、20%)的葡萄糖粉末，在溫度為25 ℃、轉速為300 r/min下用攪拌器攪拌10 min，然后加入質量分數為0.5%的甘油溶液繼續攪拌40 min，再將均勻的混合液分別轉至聚丙烯酰胺培養皿中，于-20 ℃預冷凍6 h，-80 ℃冷凍12 h，在冷凍干燥機上成型。最后對海綿進行不溶化處理，即用質量分數為80%的甲醇處理 30 min，流水沖洗3次，在室溫干燥得到絲素/葡萄糖海綿。

1.2.2 聚氨酯薄膜的制備

將一定質量的聚氨酯顆粒溶于DMF溶液中，在溫度為80 ℃、轉速為400 r/min條件下攪拌3 h，配制成質量分數為8%的聚氨酯溶液。再將聚氨酯溶液均勻涂覆在模具上，在60 ℃干燥箱中蒸發溶劑48 h成膜。為完全除掉薄膜中的溶劑DMF及雜質，將薄膜依次放入甲醇和去離子水中分別浸泡2 h和48 h，取出后將其置于60 ℃的干燥箱中烘至質量恒定，得聚氨酯薄膜。

1.2.3 雙層敷料的制備

先將聚烯烴熱熔膠(醫用級)加熱至130 ℃左右熔化，用玻璃棒將液態熱熔膠均勻涂覆在海綿周圍及中央，再將聚氨酯薄膜與海綿緊貼，并給予一定外力促進二者黏合，最后放入35 ℃烘箱中烘干2 h，得到復合型雙層敷料。

1.3 測試方法

1.3.1 吸水率測試

按照常用的測試創面敷料吸水率的方法：將敷料裁剪為2 cm×2 cm，于溫度為25 ℃，相對濕度為65%環境中平衡24 h，稱取質量m(g)；配制模擬傷口滲出液(含142 mmol的NaCl，2.5 mmol 的CaCl2)，將敷料置于自身質量40倍的滲出液中，在37 ℃下吸水至飽和，垂懸30 s后測定材料的濕態質量，記為mt(g)。吸水率計算公式為

W=[(mt-m)/m]×100%

1.3.2 溶失率測試

取2 cm×2 cm敷料，于溫度為25 ℃，相對濕度為65%環境中平衡24 h，稱取質量m1(g)，將其置于自身質量100倍的1.3.1節中滲出液的稱量瓶中，于37 ℃恒溫振蕩24 h，取出敷料后于37 ℃及50%濕度的環境中干燥后，再次平衡24 h，稱取質量記為m2(g)。溶失率(S)的計算公式為

S=[(m1-m2)/m1]×100%

1.3.3 保水率測試

取2 cm×2 cm敷料，于37 ℃下培養24 h，稱取濕態質量m3(g)。將吸水至飽和的敷料轉至干燥的稱量瓶中，置于溫度為37 ℃，相對濕度為35%的培養箱中進行失水實驗，每隔1 h(累積時間為24 h)測定其質量，記為m4(g)。則單位質量t時刻的保水率計算公式為

Q=(m4/m3)×100%

1.3.4 透濕率測試

選定適宜的柱狀容器裝入10 mL蒸餾水，容器口截面積小于敷料面積。將面積為A的敷料覆蓋在柱狀容器上，杯口用封口膜密封，整個裝置處于溫度為37 ℃，相對濕度為35%條件下，定時檢測整個裝置的質量。透濕率(g/(m2·d))計算公式為

T=Δm24/A×t

式中：Δm為前后2次質量差，g；A為樣品的透氣面積，m2；t為前后2次稱量的時間間隔，h。

1.3.5 表面形貌觀察

采用離子濺射儀對樣品噴金2次，每次50 s，然后置于掃描電子顯微鏡(SEM)中觀察樣品的表面形貌，電壓為20 kV。

1.3.6 表面官能團測試

將樣品研磨成粉末，按一定質量比加入KBr研磨混勻、壓片，制成完整的透明薄片，裝入紅外光譜儀(FT-IR)樣品艙測試其表面官能團變化，測試范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1， 掃描次數為32。

1.3.7 熱力學性能測試

采用差示掃描量熱儀(DSC)在氮氣氛圍下，于30～500 ℃范圍內測試樣品熱力學行為，升降溫速率均為10 ℃/min。

1.3.8 生物安全性測試

1.3.8.1聚氨酯薄膜的細菌穿透性檢測 首先將聚氨酯薄膜裁剪為1 cm×1 cm，用質量分數為75%的酒精浸泡5 min，然后使用磷酸緩沖溶液(PBS)清洗3次以去除酒精，紫外線照射30 min進行消毒處理。對照組為無菌紗布。

然后將消毒后的聚氨酯薄膜及無菌紗布片置于LB瓊脂平板上，將菌液稀釋，制備成1×109CFU/mL濃度的細菌懸液。吸取20 μL菌懸液接種到膜片表面均勻涂抹，注意菌液不要超出方形膜片及紗布片的范圍，于37 ℃恒溫培養24 h。

最后用鑷子仔細揭開膜片和紗布片，用無菌手術刀將膜片和紗布片下方的瓊脂塊切開，并轉移至加有2 mL PBS溶液的無菌試管內。用PBS反復沖洗瓊脂塊表面，將細菌從瓊脂塊上洗脫下來。再將試管內的PBS做一系列的倍比稀釋，常規涂板后，37 ℃恒溫培養12 h，觀察細菌生長情況。

1.3.8.2雙層敷料的細胞毒性檢測 采用MTT法檢測材料浸提液的細胞毒性。首先將細胞懸液(1×105個/mL)按每孔200 μL接種于96孔板，置于CO2培養箱內培養貼壁。完全貼壁后，棄去原培養基，分別加入材料實驗組、陰性對照組(含質量分數為10%胎牛血清的DMEM培養液)、陽性對照組(含質量分數為0.64%苯酚的DMEM培養液)各 200 μL 繼續相同條件培養，每隔24 h更換一次各組培養基。然后在1、3、5 d取出相應培養板，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況并拍照記錄。最后棄去培養基，向各孔添加20 μL質量分數為0.5%的MTT溶液繼續培養4 h，小心吸棄上清液后，向每孔再加入150 μL二甲基亞砜，酶聯免疫檢測儀震蕩 10 min，在490 nm波長下測定每組吸光度(OD)值，每組平行測定6個樣品，取平均值。相對增殖率計算公式為

式中：OD1和OD2分別為實驗組和陰性對照組樣品的光密度平均值。

2 結果與討論

2.1 雙層敷料的吸水性能分析

吸水率的大小取決于材料自身的親水基團含量及內部結構，是衡量醫用敷料好壞的重要指標之一，吸水率越大，敷料就越能快速吸收傷口處分泌的滲出液，保持創面的潔凈環境，防止細菌感染，從而有利于傷口的愈合[10]。不同質量分數Glu海綿復合PU膜雙層敷料的吸水率如圖1所示。可知：當Glu質量分數為5%和10%時，制備的雙層敷料能吸收自身體積12.5倍以上的液體量，且在50 min內達到飽和狀態，但當Glu質量分數高于15%時，吸水率則下降，這可能是由于高含量的Glu增加了材料的親水性，自身溶解所致；因此，該雙層敷料優異的吸液能力可用于合理管控傷口的滲出液，從而維持傷口愈合的微濕環境。

圖1 不同質量分數Glu雙層敷料的吸水率Fig.1 Water absorption of bilayer dressing composed of glucose with different mass fraction

2.2 雙層敷料的溶失性能分析

絲素基材料的溶失率同其自身的親水基團含量及分子結構的結晶度相關，通常用其評價生物醫學材料的體內外穩定性[11]。雙層敷料的溶失率如圖2所示。可知，雙層敷料的溶失率隨著葡萄糖質量分數的增加而增加。當Glu質量分數低于10%時，熱水溶失率增加緩慢，其值低于2%；當Glu質量分數超過10%后，雙層敷料的熱水溶失率急劇上升，其值達到5%，這是由于葡萄糖分子上含有大量的親水基團，易溶于水，從而增加了雙層敷料的溶失率。總體而言，當Glu質量分數低于10%時，雙層敷料具有更佳的穩定性。

圖2 不同Glu質量分數雙層敷料的溶失率Fig.2 Dissolubility of bilayer dressing composed of glucose with different mass fraction

2.3 雙層敷料的保水性能分析

圖3示出雙層敷料的保水率測定結果。可以看出，在4 h時，雙層敷料可保留自身60%的水分，而且雙層敷料的保水率在11 h才達到最低值，為25%。這可能是由于雙層敷料的表層PU薄膜致密的結構有效地降低了底層海綿內部水分的揮發，更好地鎖住水分，從而延長保水時間，提高保水效率。良好的保水率可為傷口提供濕潤環境，不僅有助于生長因子釋放以及細胞增殖，還能促進表皮細胞遷移，增強白細胞功能[12]。

圖3 不同質量分數Glu雙層敷料的保水率Fig.3 Water retention of bilayer dressing composed of glucose with different mass fraction

2.4 雙層敷料的透濕性能分析

為避免傷口滲出液過多在創面處聚集，減少細菌滋生，從而延長敷料的壽命，要求敷料應具有良好的透濕性[13]。雙層敷料的透濕率測試結果如圖4所示。

圖4 不同質量分數Glu雙層敷料的透濕率Fig.4 Water vapor transmission ratio of bilayer dressing composed of glucose with different mass fraction

可以看出：當Glu質量分數低于10%時，敷料的透濕率隨著Glu質量分數的增加而增加；當Glu質量分數高于10%，敷料的水蒸汽透過率則有所降低。可見在Glu質量分數為10%時，透濕率達到最大值，為(620.01±16.70) g/(m2·d)，這可能是由于雙層敷料的表層覆蓋了PU薄膜，從而使敷料總體水蒸汽透過率較低。

2.5 雙層敷料的表面形貌分析

雙層敷料的掃描電鏡照片如圖5所示。可以看出，相對于海綿材料，PU薄膜結構變得更加致密，表面出現大量的褶皺，但無孔洞現象。材料的多孔結構較為明顯，當Glu添加質量分數低于10%時，海綿內部孔洞形狀較為規則，孔壁厚度均勻，孔徑大小約為100～200 μm，而當Glu質量分數增至20%時，海綿內部的孔洞結構減少，伴隨著層片狀結構堆積，因此，Glu質量分數為10%和15%所制備的海綿，其內部孔洞相互連通，孔壁上也出現了細小觸角，可為細胞的黏附、增殖提供空間。

圖5 PU薄膜和不同質量分數Glu海綿的掃描電鏡照片Fig.5 SEM images of polyurethane membrane and glucose sponge with different mass fraction.(a) PU membrane; (b) 0; (c) 5%; (d) 10%; (e) 15%; (f) 20%

2.6 雙層敷料的表面官能團分析

本文采用紅外光譜法來分析葡萄糖的二級構象變化[14]。圖6示出本文實驗所用葡萄糖粉末的紅外光譜圖。可以看出，葡萄糖具有羰基和羥基2種官能團。在3 409 cm-1和3 313 cm-1處時出現了強且寬的吸收峰，這是葡萄糖分子中羥基的伸縮振動吸收峰。此外，葡萄糖在1 200～ 900 cm-1處也有5個明顯的吸收峰，分別為：1 149、1 111、1 078、1 024、996 cm-1，主要為葡萄糖分子中C—C、C—O、O—CH、C—OH和C—CH基團伸縮振動及其變形產生的吸收峰[15-16]。

圖6 葡萄糖的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of glucose

圖7示出SF和海綿材料的紅外光圖譜。可以看出，絲素蛋白與不同質量分數的葡萄糖共混后，其吸收峰酰胺I帶在1 629 ～ 1 636 cm-1之間，酰胺Ⅱ帶在1 521 ～ 1 528 cm-1之間，酰胺Ⅲ帶在1 232 ～ 1 233 cm-1之間，酰胺Ⅳ帶在668 cm-1處。參照絲素蛋白β-折疊構象對應的紅外光譜特征譜帶(酰胺I帶為1 625 ～ 1 640 cm-1，酰胺Ⅱ帶為1 515 ～ 1 525 cm-1，酰胺Ⅲ帶為1 222 ～ 1 250 cm-1，酰胺Ⅳ帶為700 cm-1)，分析得出不同質量分數葡萄糖添加制備的海綿材料二級結構均歸屬為β-折疊。這表明添加葡萄糖對甲醇處理后的海綿材料的β-折疊二級結構影響不大。

圖7 SF和不同質量分數Glu海綿的紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectra of SF and with different mass fraction Glu

2.7 雙層敷料的熱力學性能分析

圖8示出SF和不同質量分數Glu海綿的DSC曲線。可知，純SF的DSC曲線于289.4 ℃處出現吸熱峰，該現象表明了SF在該溫度時發生降解。Glu在163.5和220.7 ℃處出現2個吸熱峰，這是其特征峰[17]。相比純SF海綿，不同質量分數Glu制備海綿的DSC曲線分別在290.3～292.3 ℃ 之間出現了吸熱峰，均向高溫方向發生了移動，這可能是因為Glu和Gly的存在誘導SF產生更穩定的β-折疊結構，因此，降解溫度有所升高。此外，在復合材料的DSC曲線中并未出現純Glu的特征吸熱峰，這說明復合材料組分之間發生了相互作用，相容性好，未出現相分離現象，這與紅外結果一致。

圖8 SF和不同質量分數Glu海綿的DSC曲線Fig.8 DSC curve of SF and sponge with different mass fraction Glu

2.8 雙層敷料的生物安全性分析

2.8.1 聚氨酯薄膜的細菌穿透性

圖9示出聚氨酯薄膜的細菌穿透性檢測結果。

圖9 無菌紗布與聚氨酯薄膜的阻菌結果Fig.9 Resistance bacteria results of sterile gauzeand and polyurethane membrane. (a) Sterile gauze (Escherichia coli 106); (b) Polyurethane membrane (Escherichia coli 104); (c) Sterile gauze (Staphyloccocus aureus 106); (d) Polyurethane membrane (Staphyloccocus aureus 104)

從圖9可以看出，無菌紗布組洗脫下的菌液，將其稀釋至106后培養12 h的菌落計數為：大腸桿菌26個；金黃色葡萄球菌45個。而聚氨酯薄膜洗脫下的菌液，將其稀釋至104培養后，固態瓊脂板上沒有2種細菌的菌落出現。這表明大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對無菌紗布均具有穿透性，且大腸桿菌的穿透能力不及金黃色葡萄球菌，可能與這2種細菌自身的直徑有關。對于聚氨酯薄膜而言，大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均不具有穿透作用，這可能是由于在聚氨酯薄膜形成的過程中，其結構十分致密，無孔洞結構出現，才使得大腸桿菌和金黃色葡萄球菌無法穿過。因此，在日常的傷口護理中，使用無菌紗布不能有效地隔絕外界細菌的侵入，易造成二次感染。然而使用聚氨酯薄膜卻可達到阻菌的功效，這證明聚氨酯薄膜能滿足雙層敷料的阻菌性要求。

2.8.2 雙層敷料的細胞毒性

計算各組細胞的相對增殖情況，結果如表1所示。可知，各材料實驗組細胞的相對增殖率(RGR)均大于100.48%。根據GB/T 16886.5—2003《體外細胞毒性試驗》，經材料處理后培養的細胞，其相對增殖率大于75%則可被認為不具細胞毒性[18]，因此，相對增殖率數據顯示該雙層敷料無細胞毒性，有利于細胞的增殖，滿足傷口敷料的基本要求，可作進一步的研究。

表1 不同配比制備雙層敷料接種培養細胞的相對增殖率Tab.1 Relatively growth rates of bilayer dressing with different ratio %

3 結 論

本文以SF/Glu海綿(海綿底層)作為吸收層， PU薄膜(海綿表層)作為保護層，二者通過醫用熱熔膠黏連制備了一種功能性的雙層敷料。首先對該敷料進行了理化性能測試，結果表明，以Glu質量分數為10%制備的雙層敷料，其吸水率可達自身質量的12.5倍，保水時間延長至11 h，水蒸氣透過率為(620.01±16.70) g/(m2·d)。掃描電鏡測試結果表明，當Glu質量分數為10%或15%時，所制備的海綿內部形成了多孔結構，孔徑大小約為100～200 μm，這種結構或許可為細胞的黏附、增殖提供空間。紅外和差示掃描量熱測試結果表明，Glu和SF的相容性好，Glu對SF的結晶度具有加強作用，能使其維持較穩定的β-折疊二級結構。細胞毒性實驗和細菌穿透性實驗結果表明，雙層敷料無細胞毒性，PU薄膜具有良好的阻菌性能。本文實驗制備的雙層敷料性能較優，可進一步探究在臨床皮膚創面愈合的應用。

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