Sin-QuEChERS結合超高效液相色譜-高分辨質譜法快速篩查綠茶中農藥及代謝物殘留

黃合田 謝 雙 涂祥婷 楊鴻波* 郭 峰孫曉紅 段亞玲 李占彬

1(貴州醫科大學公共衛生學院，環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴陽 550025)2(國家地質實驗測試中心，自然資源部生態地球化學重點實驗室，北京 100037)3(貴州省分析測試研究院，貴陽 550016)

1 引 言

茶葉因具有防癌、抗氧化、減脂等保健功效，以及獨特的口感，被譽為世界三大飲料之一[1]。為控制病蟲害及雜草的影響，長期使用農藥, 但會導致成品茶中農藥殘留。許多國家和組織規定了茶葉中農藥殘留的最大殘留限量值(MRLs)，如歐盟、日本的相關標準分別限定了茶葉中453種和276種農藥的MRLs，多為0.01 mg/kg，甚至是不得檢出，其中未具體規定農藥的MRLs均設定為0.01 mg/kg[2,3]。我國國家標準GB 2763-2019[4]也規定了茶葉中65種農藥的MRLs，但在農藥數量和限量水平等方面仍存在一定差距。目前，不斷有茶葉中檢出氨基甲酸酯類、有機磷類和煙堿類等農藥的報道。如Huang等[5]在30個茶葉樣品中檢出21種農藥，其中，啶蟲脒、噻嗪酮等檢出率大于40%，并且呋喃丹、乙酰甲胺磷的檢出濃度和檢出率也較高。Wang等[6]檢出茶葉中殘留的15種農藥，其中，吡蟲啉的檢出濃度最高(1.09 mg/kg)。建立可靠、快速、低成本的茶葉中多種農藥殘留的同時測定分析方法，可有效提高監管效率，也是實現精準監管的基本保障。

目前，茶葉中農藥殘留的分析方法主要有免疫分析法[7]、拉曼光譜法[8]、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法(GC-MS/MS)[9～12]和液相色譜-質譜法(LC-MS/MS)[13～15]等，其中，GC-MS/MS和LC-MS/MS技術應用最廣。現有方法通常是采用標準品進行靶向分析，但分析目標物數量有限。液相色譜-高分辨質譜技術以其高分辨率、高靈敏度、抗基質干擾能力強等獨特優勢，可在無標準品的情況下，結合數據庫，以一級精確分子量、保留時間、同位素豐度比和二級特征離子為篩查條件，對環境、生物與食品等復雜樣品中潛在或未知有機污染物實現快速篩查、識別與確證。如Dzuman等[16]利用高分辨質譜技術結合農藥數據庫，在16 min內完成茶葉中323種殘留農藥的快速篩查。伍穎儀等[17]以13種農藥作為質控化合物，建立了非靶向快速篩查茶飲料中未知農藥殘留的方法。G'omez-Ramos等[18]基于高分辨質譜，建立了綠茶中139種農藥殘留的快速篩查和確證的分析方法。

茶葉中含有有機酸、生物堿和色素等物質，使得茶葉前處理存在凈化效率低、基質效應大、步驟繁瑣等困難。Saito-Shida等[15]采用液相色譜-高分辨率質譜分析了茶葉中146種農藥殘留，樣品需要經過反復提取，再經濃縮和氮氣吹干，然后檢測，操作繁瑣。農藥種類多，性質差異大，根據不同目標物極性差異，有針對性地優化匹配前處理技術，最大限度地挖掘茶葉中目標化合物的信息，減少基質效應，是實現高效分析的關鍵。目前，常用的前處理方法有QuEChERS法[16，19]和固相萃取法[12,20]，新的前處理技術，如高通量平面固相萃取[21]、乙腈-水雙水相結合分散固相萃取法[22]、漂浮固化分散液液微萃取法[23]等也被用于提高富集凈化效率。基于QuEChERS改進并優化的Sin-QuEChERS方法，采用反向分散固相萃取的基本原理，以填充多壁碳納米管(MWCNTs)和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等凈化材料的Sin-QuEChERS小柱凈化提取液，采用此方法已實現茶葉[24]、豇豆[25]和韭菜[26]等復雜基質樣品中的色素和脂類等物質的單步凈化，結合高分辨質譜可以獲取更多有效信息，但相關報道較少。

本研究選取茶葉中檢出率高、應用范圍廣、國家標準GB 2763-2019[4]規定中包括的氨基甲酸酯類、有機磷類和煙堿類共38種農藥及代謝物為質控化合物，采用Sin-QuEChERS結合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS)分析技術，通過優化色譜和質譜參數、乙腈酸度、加水量和凈化體積等條件，建立了茶葉中多農殘非靶向快速篩查的分析方法，并用于37個綠茶樣品中多農殘的非靶向分析和殘留水平分析。本方法具有簡單、快速、準確和靈敏度高等優點，適用于茶葉中多農藥殘留的快速篩查和定量分析，具有較強的實用價值。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

QExactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜系統及Dionex UltiMate 3000快速高效液相色譜系統(美國Thermo-Fisher公司); 渦旋振蕩器(上海青浦滬西儀器廠); 電子天平(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司); TG16W高速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司); Milli-Q超純水器( Advantage-10/Elix，美國Millipore公司); Sin-QuEChERS Nano茶葉凈化柱(2 g MgSO4，80 mg PSA，65 mg L-MWCNTS， 北京綠綿科技有限公司); Thermo Accucore aQ液相色譜柱(150 mm×2.1 mm， 2.6 μm， 美國Thermo公司)。

甲醇與乙腈(色譜純，德國默克公司); 甲酸(色譜純，科密歐試劑公司); 甲酸銨(色譜純，美國Fisher公司); 鹽包(6 g MgSO4, 1.5 g無水醋酸鈉， 北京綠綿科技有限公司)。

標準品：13種氨基甲酸酯類農藥混合標準、14種有機磷類農藥混合標準、11種煙堿類農藥混合標準，溶于乙腈中，濃度均為100 mg/L，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

2.2 標準溶液的配制

混合標準工作液：利用乙腈為稀釋液，將38種農藥及代謝物100 mg/L的標準溶液配制成1 mg/L的混合標準溶液，并逐級稀釋配制成1、2、5、10、20、50、100和200 μg/L混合標準工作液，現配現用。

基質標準工作液：將空白樣品按照2.3節樣品前處理方法提取基質溶液，配制7.5×10-3、1.5×10-2、3.75×10-2、7.5×10-2、0.15、0.375、0.75和1.5 mg/kg基質標準工作液，用于繪制定量分析的工作曲線，臨用現配。

2.3 樣品前處理

茶葉樣品經組織勻漿機粉碎后，在-18℃下冷凍保存，稱取2 g勻質樣品(精確到0.01 g)至50 mL具塞離心管內，加入5 mL超純水，振蕩混勻，靜置20 min，加入15 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液，振蕩混勻，加入鹽包，劇烈振蕩，渦旋振蕩3 min，4000 r/min離心5 min，將Sin-QuEChERS Nano凈化柱垂直塞入離心管內，緩慢下壓凈化柱頂部，使得離心管內的上層有機提取液自下而上穿過凈化柱內的阻水濾片和柱填料，最終進入到 Sin-QuEChERS 儲液槽內，混勻凈化液后，用移液槍從凈化柱儲液槽內取1 mL凈化上清液，過0.22 μm有機濾膜至進樣瓶，供UHPLC-Q-Orbitrap MS分析。

2.4 儀器分析條件

2.4.1 色譜條件色譜柱: Thermo Accucore aQ(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)，柱溫: 30℃; 流動相A: 0.1%(V/V)甲酸-水(含5 mmol/L甲酸銨)，流動相B: 甲醇; 梯度洗脫程序: 0～1 min，10% B; 1～3 min， 10%～75% B; 3～4 min，75%～100% B; 4～10 min，100% B; 10～11 min，100%～10% B; 11～16 min，10% B。進樣量: 5 μL，流速: 0.3 mL/min。

2.4.2 質譜條件離子源: 加熱的電噴霧離子源(HESI); 質量分析器: Orbitrap; 離子源溫度: 350℃; 離子傳輸金屬毛細管溫度: 325℃; 噴霧電壓: 3.5 kV; 透鏡電壓: 60 V; 鞘氣流速: 40 arb，輔助氣: 10 arb; 掃描模式: Full MS-ddMS2; 采集范圍:m/z100～900; 一級全掃描分辨率為70000 FWHM; C-trap最大容量(ACG target): 1×106; C-trap最大注入時間200 ms; 數據依賴二級子離子全掃描(dd-MS2)分辨率: 17500 FWHM; C-trap最大容量(ACG target)5×105; C-trap最大注入時間60 ms; 歸一化碰撞能量(NCEs): 40 eV; 動態排除: 5 s.各農藥的質譜信息見電子版文后支持信息表S1。

3 結果與討論

3.1 質譜條件的選擇

在設定的掃描范圍(m/z100～900)內，通過全掃描提取的母離子精確分子量所得的色譜峰面積進行定量分析，通過保留時間和數據依賴子離子掃描(ddMS2)所得的二級質譜離子進行定性分析。相同精確分子量的乙硫甲威和滅蟲威，通過不同的保留時間和特征碎片離子m/z107.04927和121.06472區分。質量精度是評價準確定性和定量的重要因素，實測精確分子量與理論分子量之間的相對偏差越小，表示高分辨率質譜的靈敏度越高[27，28]。如表1所示，各農藥的相對質荷比偏差小于3.8×10-6，可利用此方法得到的精確分子量， 對目標物進行定性和定量分析。

3.2 色譜條件的優化

為獲得較好的分離效果和靈敏度，考察了不同色譜柱和流動相對目標物的影響。比較了AcclaimTMPolarAdvantage Ⅱ C18(PA2)(100 mm×2.1 mm，3 μm)和Thermo Accucore aQ(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)分析柱。結果表明，兩根色譜柱上物質均有保留，但C18柱分離時,百治磷峰前伸，毒蟲畏的順反異構體不能完全分離; Accucore aQ色譜柱分離較好,峰形尖銳，且各物質的響應值均高于107。考察了水相中加入甲酸、甲酸銨對目標物離子化效率和靈敏度的影響，結果表明, 0.1%(V/V)甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液對目標物的分析靈敏度最好。其次，以甲醇和乙腈為有機相，但乙腈條件下對氧磷等物質的響應降低10倍。因此，選用0.1%(V/V)甲酸-5 mmol/L 甲酸銨溶液和甲醇為流動相。采用梯度洗脫程序，16 min內， 各物質能較好分離。圖1為基質標準溶液中部分農藥的離子流圖。

3.3 前處理條件的優化

本方法涵蓋的農藥種類較多且極性范圍較廣(lgKow=-0.74～6.37)，因此在提取和凈化時需要充分考慮各化合物的極性。由于氨基甲酸酯類農藥對pH值較敏感，酸性條件下較穩定，堿性條件下易分解，所以分別考察乙腈和含0.1%甲酸-乙腈溶液對各化合物回收率的影響。 如圖2A所示，加入適量酸后，35種物質的回收率均在70%～120%之間。因此，本方法選擇0.1%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑。

QuEChERS方法提取時，加入適量水利于有機溶劑與樣品充分接觸, 提高提取效率[29]，以獲得較好的回收率，但加入水量過多, 也會導致水溶性色素等基質的溶出。 本實驗采用Sin-QuEChERS方法是基于QuEChERS方法基礎上開發的單步凈化方法。比較了加入0、5和10 mL水對目標物回收率的影響， 如圖2B所示，加入5 mL水的實驗組的提取效率高于其余兩組，且不加水組回收率>120%的農藥有14種。 綜合考慮，本方法選擇提取時加入5 mL超純水。

凈化體積是影響凈化效率的重要因素，也進一步影響測定結果的準確性。考察了Sin-QuEChERS Nano柱凈化不同體積(1和3 mL)的提取液對38種農藥及代謝物的提取回收率影響。如圖2C所示，凈化體積為1 mL時，38種農藥及代謝物的回收率在70%～120%范圍內的數目最多(30種)，占總數的79%。比較凈化后的提取液顏色發現，隨著凈化體積增大，凈化液顏色逐漸加深，同時，部分農藥(如茚蟲威等)的回收率降至50%以下。為保證茶多酚、生物堿和色素等基質凈化效果，以及各組分的回收率均高于65%，最終選擇凈化體積為1 mL。

圖1 基質標準溶液中農藥的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion current chromatograms of pesticides in matrix matched calibrated solution

圖2 溶劑種類(A)、 加入水的體積(B)和凈化體積(C)對茶葉中38種農藥及代謝物回收率的影響Fig.2 Recovery of 38 kinds of pesticides and metabolites in tea sample with (A) different extraction solvents (n=3), (B) different volume of water (n=3) and (C) different purification volume (n=3)

3.4 基質效應

基質效應(Matrix effect，ME)是與目標物共同洗脫并干擾質譜儀電離過程的基質物質引起的，抑制或增強目標物的檢測信號[30]， 可影響儀器的靈敏度和分析結果的準確性。采用2.2節基質匹配和純溶劑標準曲線，并采用公式(1)計算ME:

ME(%)=[(S1/S2)-1]×100%

(1)

其中，S1為基質匹配標準曲線斜率；S2為純溶劑標準曲線斜率。

通常， |ME|≤10%時，基質效應可忽略不計; |ME|在10%～20%之間時，存在較弱的基質效應; |ME|>20%時，存在強基質效應。

實驗結果表明，23種化合物的|ME|為10%～20%， 10種物質的|ME|≤10%， 87%以上農藥受基質效應的影響很小。 吡丙醚等5種物質的具有較強的基質效應， |ME|>20%。因此，為校正基質效應的影響，在定量分析中使用基質匹配標準曲線。本實驗的ME評價結果與其它使用Sin-QuEChERS Nano凈化柱提取辣椒及其調味品[31]、枸杞[32]中農藥殘留的結果具有一致性，樣品中的基質物質凈化效果較好。

3.5 方法評價與質量控制

采用空白茶葉基質液配制系列基質匹配標準工作溶液，以各組分的峰面積(y)對質量濃度(x)繪制標準曲線。各農藥組分在合適的線性范圍內線性關系良好，相關系數R2>0.99。在空白茶葉樣品中添加目標物的標準溶液，以3倍信噪比(S/N=3)對應的濃度為方法檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)對應的濃度為定量限(LOQ); 按照本方法添加標準溶液，并進行添加回收率測定。3個添加水平0.01、 0.02和0.05 mg/kg，每個水平重復5次。除乙硫甲威和蠅毒磷外，其余物質的回收率為68%～115%，相對標準偏差(RSD)為0.4%～18.9%, 定量限為0.005～0.020 mg/kg。 說明本方法可用于茶葉中多種農藥殘留和代謝物的檢測分析，符合有關標準和法規的要求。方法的分析性能和加標回收實驗結果見電子版文后支持信息表S2。

3.6 實際樣品分析

茶園采摘的丹桂、金牡丹品種的37種秋季綠茶樣品， 采用本方法對其潛在殘留農藥進行快速篩查分析，以一級精確分子量、同位素豐度比和二級特征碎片離子為篩查條件。若同時滿足一級精確分子量偏差<1×10-5、 同位素豐度比>90、至少1個特征碎片離子與數據庫二級譜圖相匹配等條件, 即為通過快速篩查。結果表明，實際樣品中共檢出10種殘留農藥，如克百威、噠螨靈等，均滿足限定篩查條件。圖3為陽性樣品中提取的吡蟲啉色譜圖和質譜圖。

圖3 陽性樣品中吡蟲啉的色譜圖(A)、一級質譜圖(B)和二級質譜圖(C)Fig.3 Chromatogram (A), mass spectrum (B) and secondary mass spectrum (C) of imidacloprid in positive samples

利用標準品對快速篩查通過的殘留農藥進行進一步確證和定量分析，結果如表1所示，主要檢出6種氨基甲酸酯類和4種煙堿類農藥，其中甲萘威、異丙威、滅蚜磷、聯苯肼酯、蟲酰肼5種農藥雖檢出，但濃度均低于定量限。檢出濃度較高的農藥為速滅威、噠螨靈和吡蟲啉，殘留濃度分別為0.07、2.21和0.24 mg/kg。以上檢出農藥中，甲萘威、克百威、噠螨靈和吡蟲啉在國標GB 2763-2019中規定的MRL分別為5、0.05、5和0.5 mg/kg，其余未規定MRL值; 按照國標要求，均未超標。歐盟規定的MRLs為: 速滅威0.01 mg/kg, 噠螨靈和吡蟲啉為0.05 mg/kg; 分別有8個、2個和3個樣品超出歐盟標準限值。定量分析結果表明，本實驗建立的非靶向快速篩查方法可高通量、快速篩查綠茶中潛在的殘留農藥。

表1 茶葉中農藥的分析結果

Table 1 Analytical results of pesticide in tea samples

化合物Compounds陽性樣品Positivesample小于定量限的樣品數Number of samplesbelow LOQ最小值Minimum valve(mg/kg)最大值Maximum valve(mg/kg)最大殘留限量值MRL(mg/kg)超出MRL樣品數Number of samplesexceeding MRLCarbaryl22——0.050Carbofuran10.020.020.050Isoprocarb1212——0.010Mecarbam 22——0.050Metolcarb19110.020.070.018Propoxur1940.010.040.100Bifenazate11——0.100imidacloprid520.040.240.052Pyridaben940.022.210.053Tebufenozide99——0.100MRL, Maximum residue limit; the data was obtained from European Community (EC) Regulation 2019. LOQ, limit of quantification.

4 結 論

建立了Sin-QuEChERS結合UHPLC-Q-Orbitrap MS法非靶向快速篩查綠茶中多種農藥殘留檢測方法。樣品經Sin-QuEChERS Nano凈化柱單步凈化去除茶多酚、茶堿等干擾物質，簡化了前處理步驟，并有效提高了凈化效率。應用本方法可在16 min內完成茶葉中多農殘的快速非靶向篩查以及殘留水平的定量分析。以母離子的精確分子量、同位素豐度比、特征碎片離子為篩查條件與商業化數據庫匹配，非靶向快速篩查并結合標準品定量分析其殘留水平。本方法具有前處理簡單、凈化效率高、高通量、分析準確等優點， 且非靶向分析可以有效減少茶葉中多農藥殘留檢測中標準品用量，為茶葉中潛在農藥殘留快速篩查和分析提供了技術支持。