miR-144在前列腺癌細胞中的表達對腫瘤增殖和遷移的影響

前列腺癌（PCa）是男性中 診斷率居第二位的癌癥，也是全世界第五大最常見的男性死亡原因。近年來，雖然對前列腺癌診斷和治療的研究取得了很大進展，但前列腺癌的發病率和死亡率仍然很高[1]。前列腺癌生存率低的主要原因之一是其機制尚不清楚，缺乏有效的治療。因此，有必要揭示前列腺癌的分子機制，尋找治療前列腺癌的潛在靶點。

miRNAs是一類高度保守的非編碼小RNA分子，不僅參與細胞的增殖、凋亡、分化、信號轉導和代謝，而且參與腫瘤細胞的轉化[2，3]。它在各種疾病的發生和發展中也起著至關重要的作用。此外，miRNAs的異常是由于基因丟失和突變、表觀基因過度表達或沉默以及腫瘤轉錄因子活性異常所致[4]。大量研究表明，miRNAs在胃癌[5]、膀胱癌[6]、乳腺癌[7]和骨肉瘤[8]等多種惡性腫瘤中具有癌基因或抑癌基因的作用。然而，大多數miRNAs在前列腺癌中的表達和功能尚不清楚。

最近有研究證明，miR-144-3p在胰腺癌[9]、膠質母細胞瘤[10]、胃癌[11]等癌癥中起著抑癌作用。然而，該基因在PCa中的表達和作用尚未明確。富含脯氨酸的蛋白質11（PRR11）位于染色體17q22上，編碼360-氨基酸蛋白質。生物信息學分析表明PRR11含有2個富含脯氨酸的區域和1個鋅指結構域[12]。通過靶基因預測軟件miRanda、Target Scan 6.2顯示，miR-144與PRR11有著密不可分的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和抗體 細胞LNCaP細胞株購自東南大學附屬中大醫院泌尿外科研究所。培養于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中，胎牛血清、1640 培養基、0.2 5%胰蛋白酶購于美國Gibco公司，細胞計數試劑盒（CCK-8）、結晶紫染色液、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購于中國碧云天生物技術研究所，PRR11抗體、β-actin抗體、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、反轉錄試劑盒及實時定量聚合酶鏈凡益試劑盒購自美國 Promega 公司，miR-144模擬物（miR-144 mimics）和陰性對照（miR-NC）購自上海吉瑪公司。

1.2 實時定量反轉錄聚合酶鏈（RT-qPCR）法 用Trizol試劑從培養細胞中提取總RNA，并檢驗其純度和濃度按照反轉錄反應說明書操作，以U6作為內參，根據試劑說明書設定反應條件進行實驗，所有計算值均采用2-ΔΔCT表達mRNA相對表達量。

1.3 細胞轉染與分組 在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中，用含有10%胎牛血清1640培養基培養人前 列腺癌LNCaP細胞株。取生長良好，融合60%～80%的細胞，按Lipofectamine 2000轉染試劑說明書分別將miR-144和miR-NC轉染到 LNCaP細胞，轉染后進行后續實驗。

1.4 CCK-8法檢測LNCaP細胞增殖能力 選擇狀態良好、處于對數生長期的細胞，分別轉染miR-144和miR-NC 后進行實驗。轉染48h后，將2 000個細胞/孔接種于96孔板中，分為24、48、72、96h組，每組分別設置5個復孔，每孔分別加入10μl CCK-8試劑，繼續在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中孵育1h，用酶標儀檢測每孔的OD 值，吸收波長450nm。

1.5 Transwell實驗 選取轉染后生長良好的細胞，在24孔板中加入600μl完全培養基，取100μl無血清含2×104細胞懸液種植于Transwell小室的上室，每組3個復孔。將上室置于下室中，將小室放在細胞培養箱中培養8～14h后取出上室，用95%甲醇固定細胞15min后風干小室，再用0.2%結晶紫染色20min，每個小室隨機取5個200倍鏡視野。

1.6 Western blot實驗 將轉染過48h的細胞，用細胞及裂解液裂解細胞并提取蛋白，測定蛋白后繼續實驗。每個樣品中的蛋白質70V電壓SDSPAGE凝膠電泳30min，然后調節為110V繼續電泳80min，切膠，以200mA轉膜2h。用5%脫脂牛奶在Tris-HCl緩沖液中封閉，并在一抗孵育過夜。在TBST中洗滌3次后，在二抗中孵育2h。用ECL法顯示條帶。

1.7 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理，所有數值以均數±標準差（±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗，當P<0.05時認為差異有統計學意義，所有的數據來自3次獨立重復實驗。

2 結果

2.1 兩組轉染后LNCaP中miR-144相對表達量比較 分別提取轉染過miR-NC和轉染過miR-144細胞RNA，逆轉錄成cDNA進行熒光定量PCR實驗。miR-144組表達量明顯高于miR-NC組（1494±94.63 vs 0.8733±0.1157，P<0.0001），見圖1A。

2.2 兩組抑制前列腺癌細胞株LNCaP增殖能力比較 與轉染miR-NC組相比，轉染miR-1 44組明顯抑制前列腺癌LNCaP細胞株增殖能力（P<0.01）。見圖1B。

2.3 兩組抑制前列腺癌細胞株LNCaP遷移能力比較 過表達miR-144之后LNCaP細胞體外遷移能力與轉染miR-NC細胞相比顯著降低（143.0±6.351 vs 196.0±16.20，P=0.0382），見圖1C。

2.4 miR-144調控前列腺癌LNCaP細胞株中PRR11的表達 采用靶基因預測軟件miRanda、Target Scan 6.2等，結合文獻，預測PRR11是miR-144的潛在下游靶基因：PRR11 3'UTR-WT：5'-GUAUGGAGCC CACACAUACUGUG-3'；miR-144-3P：3'-UCAUGUA GUAGAUAUGACAU-5'；PRR11 3'UTR-MUT：5'-GUAUGGAGCCCACACAGCAACUG-3'。在前列腺癌細胞株LNCaP細胞中轉染miR-144 mimics及miR-NC后，根據實驗方法中的操作步驟，分別提取兩組細胞的蛋白，測定蛋白濃度后進行Western blot實驗。實驗結果證明過表達miR-144后，LNCaP細胞中PRR11的表達量顯著下降（P=0.030），miR-144與PRR11呈負向調控關系。見圖2。

圖1 miR-144體外抑制前列腺癌細胞LNCaP增殖和遷移

圖2 miR-144抑制前列腺癌細胞株LNCaP中PRR11相對表達量

3 討論

前列腺癌的發病率在美國已經超過肺癌，成為首位危害男性健康的腫瘤，占男性腫瘤發病率的28%。據美國癌癥協會的估計，2011年美國有240 890新發病例，有33 720人死于前列腺癌[13]。miRNAs在多種腫瘤細胞中起關鍵作用，包括腫瘤生長、凋亡和腫瘤細胞轉移，可作為癌基因或抑癌基因[14，15]。此外，應用不同miRNAs在血漿、血清和腫瘤標本中的表達譜對人類癌癥進行了準確分類，提示miRNAs可能是診斷人類癌癥和患者預后的生物標志物[16]。這些結果都證明miRNAs對腫瘤的發生有著重要作用，迫切需要我們揭示miRNAs在前列腺癌進展過程中的作用機制。有研究表明，很多miRNAs可參與前列腺癌進展過程。Guan等[17]報道，miR-218在前列腺癌組織和細胞株中的表達下調，并且通過直接靶基因Gli1抑制前列腺癌細胞的遷移、上皮間充質轉換。Hu等[3]發現miR-212通過調控MAPK1抑制前列腺癌細胞增殖和侵襲。同時，Mushtaq等[11]報道，miR-144通過下調AP4抑制胃癌細胞增殖和侵襲。

據報道，PRR11在癌癥發展中起重要作用，Zhou等[12]研究表明在ESCC細胞株中PRR11的mRNA和蛋白水平顯著高于NEECs，同時過表達的PRR11促進食管鱗狀細胞癌的成瘤能力，并與食管鱗狀細胞癌的進展有關。另外，Qiao等[18]研究結果說明敲除PRR11可以 通過β-catenin信號通路抑制肝細胞癌生長和上皮間充質轉化。

本研究結果顯示，miR-144通過下調PRR11抑制前列腺癌細胞株LNCaP增殖、遷移。說明miR-144在前列腺癌發展過程中發揮著重要的抑制作用，此作用可能與PRR11的表達有著密不可分的關系。