MTB和BCG誘導中性粒細胞胞外捕獲網形成方法的建立

結核病是由人類特有的胞內病原體—結核分枝桿菌引起的，并通過呼吸道在人與人之間傳播的一種慢性傳染性疾病。結核分枝桿菌具有特殊的細胞壁結構，含豐富的脂質，對外界環境和藥物有很強的抵御能力。細胞內生長的結核分枝桿菌致病機制已經研究得很透徹，而胞外生長的結核分枝桿菌引起的病理變化則很少涉及[1～3]。長期以來，人們圍繞結核病免疫相關的T淋巴細胞（尤其是CD4+的Th1細胞）、巨噬細胞和樹突狀細胞（dendritic cells，DC）進行了大量研究，并取得了一些進展。目前，多數研究者肯定的觀點是，Th1型免疫應答在結核病的適應性免疫應答中起關鍵作用，是介導結核病保護性免疫的主要群體；巨噬細胞作為機體抗MTB感染的主要免疫效應細胞，在結核病的保護性免疫應答中也發揮著重要作用。但是，對于參與結核病免疫的另一個重要細胞群體，也是MTB感染后最先由外周血遷移至感染病灶的細胞—中性粒細胞的研究卻明顯滯后[4]。本研究擬通過結核分枝桿菌和卡介苗誘導中性粒細胞形成NETs（neutrophil extracellular traps）結構，探討中性粒細胞在結核感染過程中所扮演的角色，揭示卡介苗預防結核分枝桿菌感染的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 結核分枝桿菌國際標準株、BCG菌種由北京結核病胸部腫瘤研究所提供，胎牛血清（FBS）、RPMI-1640、Middlebrook 7H9培養基購自美國Sigma公司，Sytox? Green 試劑盒購自美國Eugene公司，人中性粒細胞提取試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，抗-H3Cit、抗-MPO抗體購自Abcam公司，Quant-iTTMPicoGreen ? dsDNA Reagent and Kits購自ThermoFisher公司。人外周血標本來自本院健康體檢志愿者，無外傷、感染病史，HBV、HCV、HIV均陰性，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 取標準株H37Rv和BCG接種于5ml無菌7H9液體培養基中，37℃搖床恒溫箱中培養3～4周，搖床速度為100～120轉/h，吸取100μl菌液接種于5ml新鮮7H9液體培養，繼續搖床培養7～10d。取菌液100μl重懸于PBS中，調整至麥氏濃度0.5。

1.2.2 中性粒細胞分離 取10ml離心管一支，將健康志愿者EDTA抗凝血4ml小心加到4ml中性粒細胞分離液之上。3 000r/min，水平離心30min，離心后吸取中性粒細胞層后加入紅細胞裂解液，充分裂解后離心，3 000r/min，30min后取中性粒細胞層加入PBS洗滌。用含5%FBS的RPMI-1640培養基重懸后進行細胞計數。

1.2.3 NETs誘導 加入0.5ml中性粒細胞重懸液（含細胞數4×105個）于24孔細胞培養板，放入多聚賴氨酸處理的無菌玻片，5%的CO2培養箱中1h靜置處理細胞，對照組、MTB組、BCG組分別加入PBS、MTB、BCG各0.5ml，各組設平行3組。5% 的CO2培養箱中3h后收集細胞上清，用于檢測游離DNA。各孔加入0.5ml 4%多聚甲醛，4℃固定過夜，用于免疫熒光染色。

1.2.4 NETs檢測 免疫熒光染色：從6孔板中取出細胞爬片，PBS洗滌3次，0.5%Triton X-100透化1min，PBS洗滌3次，加入5%FBS于37℃濕盒中封閉30min。加入一抗（抗-H3Cit 1∶400，抗-MPO 1∶400）于37℃濕盒中封閉1h。PBS洗滌3次后加入二抗（抗-H3Cit 1∶1000，抗-MPO 1∶1000）于37℃濕盒中封閉1h。PBS洗滌3次后加入DAPI避光染色10min，加封片劑封片。激光共聚焦顯微成像儀檢測NETs。

1.2.5 游離DNA定量檢測 按Quant-iTTMPicoGreen ?dsDNA Reagent and Kits試劑盒說明書進行操作，倍比稀釋標準品制作標準曲線，激發光波長480nm，發射光波長520nm，熒光檢測儀檢測熒光信號并記錄結果。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NETs的激光共聚焦顯微成像 激光共聚焦顯微成像分析發現：中性粒細胞在BCG和MTB的刺激下，可見絲狀或環狀DNA骨架結構，H3Cit和MPO附著于DNA骨架結構上。中性粒細胞的體積增大，且產生環狀或絲狀骨架結構的細胞比例增多。BCG組和MTB組標記H3Cit和MPO顆粒物的熒光強度較對照組明顯增強，即DNA骨架結構上附著的H3Cit和MPO顆粒數量增多，見圖1。

圖1 NETs免疫熒光染色

2.2 游離DNA含量 中性粒細胞經BCG和MTB刺激后，上清中游離DNA含量較對照組顯著增高（P<0.05），MTB刺激組游離DNA含量明顯高于BCG刺激組（P<0.05）。該結果與免疫熒光染色結果一致，證明中性粒細胞經BCG和MTB刺激可形成NETs，且MTB刺激效率明顯強于BCG，見圖2。

圖2 游離DNA含量

3 討論

盡管中性粒細胞占外周循環白細胞數量的50%～80%，但其吞噬作用一直被低估，免疫學的研究重點主要集中在單核吞噬細胞如單核細胞和巨噬細胞。中性粒細胞通過直接吞噬細菌、脫顆粒及細胞因子的分泌，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1（IL-1）來發揮先天性免疫作用。2004年Brinkmann等[5]首先報道了中性粒細胞活化后會在胞外形成類似網狀的結構—中性粒細胞胞外捕獲網，并認為這是中性粒細胞發揮先天性免疫作用的一種重要機制。NETs由雙鏈DNA的骨架結構和具有抗菌活性的蛋白質：髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組蛋白和中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）等組成。病原微生物（包括結核分枝桿菌）、多種促炎因子（IL-8、TNF-α等）、活化血小板、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和乙酸肉豆蔻佛波酯（phorbolmyristateacetate，PMA）等多種生物化學因子均可以刺激中性粒細胞NETs形成[5]。NETs是血漿中游離DNA（cell-free DNA，cf DNA）的重要來源，因此有研究認為檢測血漿中cf DNA濃度可以作為反映NETs形成的一種方式[6]。目前主要有3種方法通過檢測NETs組分用于NETs的檢測[7]：①檢測NETs的DNA骨架結構，通過SYTOX染色的方式進行檢測，這種染料可以直接插入游離的DNA中且不會對活細胞產生影響；②通過免疫熒光染色檢測NETs組分髓過氧化物酶和組蛋白H3Cit，用來區分核DNA與細菌、線粒體DNA的組蛋白；③檢測中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）濃度來反映NETs的水平。本研究通過免疫熒光染色檢測NETs組分MPO和H3Cit及檢測cf DNA證實MTB和BCG能夠在體外誘導NETs形成并建立成熟的誘導方法。

結核分枝桿菌是逃避免疫系統最成功的胞內病原體之一，主要感染呼吸系統，但也可能影響其他器官，與其他致病菌不同的是不產生毒素。由于結核分枝桿菌屬于胞內感染，細胞外的中性粒細胞在結核病中可能扮演的角色被忽略。中性粒細胞可以分泌活性氧（ROS）、彈性蛋白酶、膠原蛋白酶和髓過氧化物酶，通過這些物質以一種非選擇性的方式直接殺滅結核分枝桿菌和受感染的宿主細胞或者通過調節早期炎癥反應增強巨噬細胞對結核桿菌的清除能力，這些對于控制結核感染至關重要[8，9]。結核分枝桿菌利用吞噬細胞復制，也作為傳播至整個宿主生物體的一種方式。中性粒細胞聯合巨噬細胞可以有效地抑制結核感染，并有助于早期肉芽腫形成[10]。肉芽腫是一種由免疫細胞組成的結構，用于應對原發性感染。結核分枝桿菌通過增加中性粒細胞的凋亡以阻止其產生肉芽腫來包裹這些細菌，凋亡中性粒細胞的胞葬作用導致免疫應答向促炎方向轉化。不同基因型的結核分枝桿菌都可誘導中性粒細胞形成NETs。NETs 能夠有效地捕獲侵入的分枝桿菌，隔離有毒物質以保護周圍組織免受損害，但無法殺滅捕獲的結核分枝桿菌[11，12]。

大量的體內和體外試驗研究證實中性粒細胞具有吞噬結核分枝桿菌的能力。在小鼠感染BCG或MTB一天后，中性粒細胞聚積在小鼠肺組織和呼吸道中，其中1.6%的中性粒細胞內含有結核分枝桿菌[13]。在體外分離的感染結核分枝桿菌的人肺組織中，大約7%的感染細胞是中性粒細胞[14，15]。而關于中性粒細胞殺死結核分枝桿菌的數據相互矛盾。有研究發現中性粒細胞的抗細菌活性較差，即使被IFN-γ刺激（能夠激活巨噬細胞的抗菌性能），抗細菌活性也沒有明顯增強[13，16]。而另外的研究報道中性粒細胞和中性粒細胞衍生的殺菌分子確實能在體外殺死結核分枝桿菌[17，18]。中性粒細胞對MTB的殺傷能力較差，這使得一些研究者認為它們隱藏著結核分枝桿菌，從而逃避巨噬細胞的殺傷作用[19]。另一方面，中性粒細胞增加了巨噬細胞的殺菌活性：巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞，并利用其殺菌肽對抗細胞內MTB[20]。部分中性粒細胞的殺菌活性是由中性粒細胞胞外捕獲網介導的，中性粒細胞經MTB刺激能釋放含有中性粒細胞彈性酶和組蛋白的胞外捕獲網，但不能殺死MTB[21]。此外，有人認為胞外捕獲網可能為細胞外結核的生長提供了一個平臺，從而有助于迅速擴大肺部病變[22]。另外中性粒細胞胞外捕獲網可通過降低T細胞的活化閾值直接激活T細胞[23]。熱休克蛋白72（HSP-72）對消除結核分枝桿菌具有重要作用，HSP-72存在于凋亡細胞和壞死細胞中，同時在NETs內的DNA也被發現，這些對于遏制和消除結核分枝桿菌具有重要意義[24]。

綜上所述，關于中性粒細胞是否能夠殺死MTB存在很大爭議。這些具有極高殺菌潛力的中性粒細胞及NETs對分枝桿菌是否有明確的殺菌作用，還有待進一步研究探討。