多發性骨髓瘤骨髓組織中磷脂酰肌醇-3激酶表達及其臨床意義

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）為骨髓漿細胞惡性疾病，約占整個血液系統惡性腫瘤的10%以上，多見于老年人，現階段隨著人口老齡化進程的加快，我國MM的發病率逐年升高[1]。目前MM的治療主要通過聯合化療及自體干細胞移植，然而治療過程中僅有一小部分患者受益，絕大多數患者的生存和預后并未得到改善，因此尋找更有效的治療方案與手段對改善MM患者的預后具有重要意義[2，3]。磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）由蛋白質合成，在轉錄與翻譯過程中調節靶基因的表達，與腫瘤的發生及發展密切相關，參與細胞周期調節，促進腫瘤細胞的增殖[4，5]。本研究通過檢測MM患者骨髓血漿PI3K水平，判斷其在不同分期患者中的差異，闡述其與患者預后的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月～2015年5月我院住院MM患者40例，其中男19例，女21例；年齡40～75歲，平均（56.33±3.59）歲；依照DS分期標準包括Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期18例。另選取同期于我院門診就診者，通過臨床和骨髓穿刺排除血液疾病，其中男20例，女20例；年齡41～77歲，平均（56.18±3.66）歲。納入標準：①所有患者均簽訂骨髓穿刺同意書，通過臨床和骨髓穿刺、免疫固定電泳等檢查確診；②經醫院倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。排除標準：①肝實質病變或有機磷中毒者；②原發性漿細胞白血病或反應性漿細胞增多癥者；③合并慢性呼吸道疾病；④合并其他惡性腫瘤、創傷或感染者；⑤合并其他全身性疾病者。

1.2 免疫組織化學法 所有非腫瘤骨髓組織標本通過10%的中性福爾馬林進行固定，通過石蠟包埋后制片，通過免疫組織化學SP三步法進行檢測，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，修復抗原，在室溫條件下以3%的H2O2孵育20min，滅活過氧化物酶活性，PBS液沖洗，滴加正常山羊血清工作液，于室溫條件下孵育20min，加入一抗，4℃條件下放置12h，再次以PBS液沖洗，滴加二抗，孵育25min，再以PBS液沖洗，加入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，孵育25min，PBS液沖洗，以DAB顯色液顯色，最后采用蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。

1.3 染色結果判斷 由2名病理科醫師采用雙盲法評估。在高倍鏡下隨機選取5個以上的不同高倍鏡視野，同時需保證每一個視野能夠觀察到的細胞數在200個以上，陽性細胞表達為細胞質呈現淡黃色或棕黃色，依照陽性細胞所占的百分比進行評分[6]：陽性細胞≤5%計0分，陽性細胞為5%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分，0分為無表達（-），1分為低表達（+），2分為中度表達（++），3分為高表達（+++），4分為極高表達（++++）。

1.4 化療方案 采用VAD+MelP（VCR 0.5mg d1～d4，THP 10mg d1～d4，DEX 20mg d1～d4，MelP 6mg Bid d1～d4），合并腎功能不全者，可依據肌酐清除率水平調整MelP用量；合并尿毒癥患者，不使用MelP；合并骨骼病變患者，化療前使用兩次2、3代骨磷酸鹽，骨骼癥狀明顯或孤立病灶加用局部治療。

1.5 臨床病理特征

1.5.1 DS臨床分期標準 Ⅰ期：血鈣正常，血紅蛋白≥100g/L，X線顯示骨髓表現正常或僅存在少量孤立性漿細胞，IgA＜30g/L，IgG＜50g/L，尿本周蛋白＜4g/24h；Ⅱ期：介于Ⅰ期和Ⅲ期之間；Ⅲ期：符合以下一項或多項：血紅蛋白＜85g/L，血鈣水平＞2.98mmol/L，多處發生溶骨性病變，IgA＞50g/L，IgG＞70g/L，尿本周蛋白＞12g/24h[7]。

1.5.2 ISS分級標準 1級：血清β2微球蛋白含量＜3.5mg/L，血清白蛋白含量＞35g/L；2級：介于1級和3級之間；3級：血清β2微球蛋白含量＞5.5mg/L[8]。

1.5.3 骨病分級 0級：未出現骨質破壞；1級：普通骨質疏松或有1處出現骨質溶骨性破壞；2級：超過1處少于3處出現骨質破壞癥狀；3級：超過3處出現骨質破壞，或出現病理或壓縮性骨折[9]。

1.5.4 生活自理狀況 1級：患者存在臨床癥狀，但不影響日常生活；2級：患者日常生活可自理，且每日需臥床休息半天以下；3級：患者日常生活可自理，且每日需臥床休息半天以上；4級：患者臥床不起，生活不能自理[10]。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件，率之間的比較采用卡方檢驗，生存率分析通過Kaplan-Meier模型，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PI3K在正常及MM骨髓組織中的表達 MM患者骨髓組織中PI3K陽性表達率高于正常骨髓組織，見表1。

表1 PI3K在正常與MM骨髓組織中的表達情況比較

2.2 PI3K表達和臨床病理特征之間的關系 骨質破壞≥3分、日常生活自理能力較差患者PI3K陽性率高于其他患者，DS分期Ⅲ期患者PI3K陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，ISS分級3級患者PI3K陽性率高于1～2級患者，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 MM骨髓組織中PI3K表達與臨床病理特征的關系[n（%）]

2.3 PI3K陽性與陰性表達MM患者化療后生存時間 PI3K陰性患者3年無進展生存率為72.73%，高于PI3K陽性組48.28%（P<0.05）；PI3K陰性患者3年總生存率為81.82%，高于PI3K陽性患者62.07%，（P<0.05）。見圖1、2。

圖1 3年無進展生存率

圖2 3年總生存率

3 討論

MM腫瘤細胞起源于漿細胞，其發病和癌基因的激活與抑癌基因的失活及骨髓微環境的改變、多種細胞因子相互作用等因素有密切關系，患者常伴有多發性溶骨性損害、貧血、高鈣血癥、腎臟損害，患者由于正常的免疫球蛋白的生成受到抑制，易導致各種細菌性感染的發生[11]。

PI3K由一個催化亞基和一個調節亞基構成，細胞受到生長因子刺激后，PI3K活化[12]。PI3K下游的Akt可與PIP3結合，并經磷脂酰肌醇依賴性激酶1，2使第308位上的蘇氨酸及473位上的絲氨酸被激活。活化后的PI3K/Akt通路激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，磷酸化后進一步激活P70S6激酶，使下游核糖體S6激酶活化，促進核糖體蛋白的翻譯過程，與此同時哺乳動物雷帕霉素靶蛋白還可將4EBP1磷酸化，使其從elF4E中解離，促進后者對于cyclinD1等周期調節蛋白的翻譯過程。PI3K信號通路可調節細胞周期，具有抗凋亡和調節瘤細胞生存的作用，還有利于血管的形成，增強腫瘤的侵襲性，促進腫瘤的轉移[13]。

本研究中MM患者骨髓組織PI3K陽性率明顯高于正常組織，MM組織中PI3K信號活化，促進瘤細胞增殖與分化過程，反過來又進一步活化更多PI3K信號，使得PI3K濃度進一步升高。本研究對比各種免疫類型骨髓血漿PI3K陽性率差異，其中IgE和IgD類型本研究未納入有效病例，對比其他幾種免疫類型和PI3K陽性率的關系，IgG型、IgA型、輕鏈型PI3K陽性率均未有明顯差異，提示PI3K表達增高可能是各種類型MM患者表現出的一種共同信號，也有可能與本研究所納入的樣本數量過少有關。DS臨床分期側重評估患者總體瘤負荷，涉及多種參數[14]。本研究中Ⅲ期患者PI3K陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期患者，表明患者體內PI3K水平和瘤負荷相關。ISS臨床分期是近年來提出的MM臨床分期指標，雖只涉及血清β2微球蛋白和血清白蛋白含量，但血清β2微球蛋白和體內骨髓瘤細胞總數密切相關，血清白蛋白是負性急性期蛋白，與瘤細胞的生活與增殖具有密切關系，因此ISS臨床分期在預測MM患者化療治療后的生存情況方面具有重要價值，本研究中ISS臨床分期和MM患者PI3K陽性率相關，提示瘤負荷狀態，對于負荷越高者，其包括自分泌或旁分泌在內激活的PI3K信號的途徑則越強，上述研究顯示，PI3K陽性表達率越高者，疾病分期更接近于晚期。

林琳等[15]研究表明骨骼破壞為MM患者最常見的臨床癥狀之一，瘤細胞和骨髓基質細胞相互黏附后激活大量破骨細胞激活因子等，導致破骨細胞和成骨細胞動態平衡遭到破壞，造成溶骨性破壞。MM患者瘤負荷越高，骨質破壞越嚴重。本研究中PI3K水平與骨髓瘤的分級有關，PI3K的陽性表達率隨骨質破壞嚴重程度增高。同時本研究中患者日常生活自理能力與PI3K陽性表達率存在一定的關系，這也從側面說明了PI3K的陽性表達和骨髓病變的嚴重程度相關，Piddock 等[16]研究結果支持本結論。對兩組患者隨訪至化療治療后3年，PI3K陽性表達患者3年無進展生存率與總生存率均低于PI3K陰性表達患者，闡明了PI3K在預測MM患者預后方面的價值。

綜上所述，PI3K在MM骨髓組織中高表達，與患者臨床病理特征具有密切關系，可作為判斷MM患者預后的標志物之一。