LC-MS/MS法測定比格犬血漿中匹莫范色林濃度及藥代動力學研究

馬婷婷，左琳，陳嬌

(夸克俠醫藥科技<遼寧>有限公司生物分析中心，遼寧 本溪 117000)

帕金森病(PD)是最常見的神經退行性疾病之一，僅次于阿爾茨海默病[1]。帕金森病的主要特征是一系列被稱為帕金森癥的運動癥狀，包括震顫、肌強直、運動遲緩以及姿勢平衡障礙[2]。研究發現，50%以上的PD患者會伴發錯覺、幻覺、妄想等精神癥狀[3]。在疾病的初始階段，左旋多巴是改善PD運動癥狀最有效的療法，左旋多巴的治療重點是緩解癥狀，恢復多巴胺水平，改善運動癥狀[4-6],但長期應用多巴胺制劑，會引發躁狂、視幻覺、妄想癥和偏執癥等精神病癥副作用[7]。實驗證明多巴胺激動劑的治療方式可延緩運動障礙的發生。PD首選治療方法為盡可能減少抗帕金森藥物多巴胺劑量，聯合抗精神病藥對于治療藥物誘發的精神精神障礙有效[8-10]。由于大多數抗精神病藥物在改善精神病方面具有相似的療效，臨床上在選用精神病藥時主要考慮其不良反應。臨床常用氯氮平，喹硫平治療帕金森精神病，但是這兩種藥不良反應較大，氯氮平對帕金森病最常見的副作用是過度鎮靜、直立性低血壓、流涎和粒細胞減少,并且證實氯氮平的使用與死亡率、癲癇發作、心肌炎和其他心血管和呼吸系統疾病的風險增加有關；喹硫平最常見的副作用為體位性低血壓、過度鎮靜，與氯氮平相比，不能改善震顫[11-12]。由Acadia制藥公司研發的治療帕金森精神病的新型藥物匹莫范色林，屬于有效的5-HT2A反向激動劑,對 5- HT2A受體具有較高的親和力,而對5- HT2C受體親和力低，特別是對多巴胺D2受體或組胺受體幾乎無作用[13-14]，與非典型抗精神病藥物不同的是，匹莫范色林選擇性高、耐受性好，即使在高劑量下也不會誘發過氧化氫癥，或引起運動效應,無嚴重不良反應[15]。2016 年 4 月 29 日，匹莫范色林成為美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的首個用于治療伴有幻覺和妄想等精神癥狀的帕金森病患者的藥物[16]。

然而，匹莫范色林作為一種新藥，藥物動力學信息有限。目前關于匹莫范色林藥物代謝動力學的系統研究較少，因此，更有必要對體內的藥動學特征進行更進一步的研究。在本研究開發并驗證了一種專屬、靈敏、快速的液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法，測定比格犬血漿中匹莫范色林的質量濃度，并將所驗證的方法應用于匹莫范色林在比格犬體內的藥代動力學研究[7]，為匹莫范色林在人體內的藥代動力學研究提供參考依據。

1 材料

1.1 試劑與試藥 匹莫范色林對照品(純度為98.0%，中國食品藥品檢定研究院)；卡馬西平對照品(純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院)；匹莫范色林片[17 mg/片，夸克俠醫藥(遼寧)有限公司]；乙腈(色譜純，Sigma-Aldrich公司)，異丙醇(色譜純，成都市科隆化學品有限公司)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；甲基叔丁基醚(色譜純，成都市科龍化工試劑廠)；純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2 實驗動物 健康雄性比格犬8只，體重9.5～12.3 kg，購于北京瑪斯生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0001；實驗動物使用許可證號：SYXK(遼)2018-0009。實驗動物房通風良好，裝備空調，溫度保持在16～26 ℃，濕度保持在40%～70%，明暗照明各12 h，每只比格犬均用耳部文身標記，并在籠具上標注試藥編號與劑量。

2 方法與結果

2.1 給藥方案與血樣采集 健康比格犬8只，給藥前禁食12 h，自由飲水。灌胃給藥1片(劑量17 mg/片)。采用比格犬前肢隱靜脈取血方式，受試者于給藥前(0 h)及給藥后5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、60 min、1.25 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h采血約0.5 mL，置于含肝素鋰的采血管中，立即于4 ℃離心機以4 000 rpm離心10 min，取血漿-20 ℃冷凍保存。

2.2 色譜條件和質譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)；流動相A：水(含5%乙腈，0.1%甲酸)，流動相B：乙腈(含0.1%甲酸)，流速1.2 mL·min-1，梯度洗脫程序為：0 min，30%B；1 min，95%B；3.6 min，95%B；3.61 min，30%B；4.5 min，30%B。柱溫40 ℃，自動進樣器溫度4 ℃，進樣量為5 μL。

質譜方法：AB4500三重四級桿串聯質譜儀(AB Sciex,USA)，離子源為ESI源，檢測方式為正離子檢測，掃描方式為多反應監測(MRM)方式，定量分析時的離子對分別為m/z： 428.4→223.2(匹莫范色林)、m/z：237.0→193.9(卡馬西平，內標)，噴霧電壓(IS)：5 500 V，源溫度(TEM)：550 ℃，氣簾氣(CUR)：25 psi，霧化氣(GS1,GS2)為55 psi，碰撞氣(CAD)：8 V，質譜入口電壓(EP)分別為10.00和8.83，去簇電壓(DP)分別為110.0和100.0，碰撞能(CE)分別為25.0和29.0，碰撞室出口電壓(CXP)分別為7.0和13.8。

2.3 標準溶液的制備 取匹莫范色林對照品約10 mg，精密稱定，置于30 mL稱量瓶中，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀釋至1.000 mg·mL-1。精密移取上述儲備液適量，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀釋，獲得濃度為1、2、10、20、100、200、360和400 ng·mL-1的匹莫范色林標準工作溶液及濃度為3、40和320 ng·mL-1的質控(QC)工作溶液。取卡馬西平對照品10 mg，精密稱定，置于30 mL稱量瓶中，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀釋至1.000 mg·mL-1的內標儲備液。用純凈水將內標儲備液逐級稀釋至5 ng·mL-1的內標工作溶液。

2.4 血漿樣品的制備 取待測血漿樣本100 μL，加入內標工作溶液(含卡馬西平：5 ng·mL-1)50 μL，渦旋1 min，加入1 mL甲基叔丁基醚，渦旋2 min，于10 ℃、10 000 rpm離心10 min。取上清液800 μL，于40 ℃真空離心濃縮至干燥。加入復溶劑(乙腈含1%甲酸)100 μL，渦旋2 min，取上清液5 μL進樣分析。

2.5 方法學確證

2.5.1 選擇性 分別取6個不同來源的比格犬空白血漿，按照“2.4”項下(無內標無待測物)的方法進行處理，進樣分析。結果表明比格犬空白血漿樣品中干擾組分的響應低于當批次LLOQ待測物響應均值的20%及內標響應均值的5%，比格犬血漿中的內源性物質不干擾分析物和內標的定量分析，該方法具有良好的專屬性(見圖1)。

圖1 比格犬血漿中匹莫范色林(Ⅰ)和卡馬西平(Ⅱ)的典型MRM色譜圖

2.5.2 標準曲線和定量下限 精密量取空白血漿190 μL，分別加入匹莫范色林標準工作溶液各10 μL，配制成含匹莫范色林分別為0.05、0.1、0.5、1、5、10、18、20 ng·mL-1的標準曲線血漿樣品，取出100 μL上述樣本，其余過程依照“2.4”項下操作，進樣分析。以待測物濃度為橫坐標(X)、待測物與內標物的峰而積比值為縱坐標(Y)，采用加權最小二乘法(權重1/X2)進行回歸運算，求得標準曲線方程。試驗結果表明，匹莫范色林在0.05～20 ng·mL-1濃度范圍內r均大于0.99，線性關系良好，定量下限為0.05 ng·mL-1。

2.5.3 精密度和準確度 精密量取空白血漿190 μL，分別加入匹莫范色林質控工作溶液各10 μL，配制成血漿中匹莫范色林濃度分別為0.15、2、16 ng·mL-1的質控樣品，取出100 μL上述樣本，其余過程參照“2.4”項下。取定量下限樣品及低、中、高濃度質控樣品進樣分析，進行批內與批間精密度準確度和精密度考察。每個濃度6樣本，連續考察3個分析批。考察結果見表1，精密度和準確度均滿足生物樣品定量測定的要求。

表1 批內和批間精密度和準確度試驗結果

2.5.4 提取回收率和基質效應 采用低、中、高3個濃度的質控樣品評估匹莫范色林的提取回收率與基質效應,正常處理的質控樣品與來空白血漿(分別取6個不同個體的比格犬)提取后加入標準溶液的樣品響應值的比值為提取回收率；空白血漿提取后加入標準溶液的樣品與相同濃度標準溶液響應值的比值為基質效應。本試驗所得基質效應值均經內標歸一化校正。結果顯示，低、中、高3個濃度質控樣品提取回收率的均值分別為61.2%、62.4%，63.2%，同法考察得內標的提取回收率66.7%。低、中、高3個濃度的質控樣品基質效應均值分別為1.017、1.026、1.000，表明基質效應可忽略不計。

2.5.5 樣品穩定性 采用低、高2個濃度的質控樣品考察比格犬血漿中匹莫范色林的穩定性，考察的條件分別為未處理血漿樣品室溫條件下放置20 h、處理后樣品室溫放置25 h、運輸穩定性、自動進樣器(4 ℃)放置48 h、凍融循環5次、-20 ℃長期穩定性(放置29 d)、-70 ℃長期穩定性(放置31 d)，依照“2.4”項下處理，各濃度水平進行6樣本分析。試驗結果見表2，表明低、高2個濃度的質控樣品在各條件下，匹莫范色林濃度無明顯變化，穩定性良好。

表2 低、高2個濃度的質控樣品在不同條件下的穩定性

2.5.6 稀釋可靠性 配制高于定量上限的血漿樣本，加入空白血漿稀釋5倍后參照“2.4”項下處理樣品，進行6樣本分析。試驗結果表明，測得樣品濃度的RE和CV%均小于15%，表明高濃度樣本稀釋5倍后測得的準確度良好。

2.5.7 殘留效應 定量上限樣品后注射空白樣品來評估殘留。結果顯示，空白血漿樣品中匹莫范色林響應值未超過當日檢測定量下限最低響應值的20%，內標干擾物的最大響應值未超過當日檢測內標平均響應值的5%，表明殘留效應考察符合要求。

2.6 比格犬體內藥代動力學研究 8只健康比格犬單劑量口服匹莫范色林片后平均血藥濃度-時間曲線見圖2。使用WinNonlin 6.1軟件的NCA模塊計算藥動學參數，結果見表3。結果表明，平均Cmax為5.608 ng·mL-1，平均Tmax為0.83 h。AUC0～24 h和AUC0～∞個體差異較大，且與文獻報道的受試者AUC0～24 h和AUC0～∞差異很大[17]，造成這種差異的原因可能是人與比格犬對匹莫范色林的吸收機制不同。因此有必要進一步研究匹莫范色林在不同物種間和同一物種不同劑量的藥代動力學特征，進而論證其劑量與藥代動力學和藥效學的相關性。

圖2 比格犬單劑量給藥后匹莫范色林的平均血藥濃度-時間曲線圖

表3 單劑量口服給藥后測得的藥動學參數

3 討論

本文首次建立了測定比格犬血漿中匹莫范色林的液相色譜-質譜/質譜法。本方法簡單、靈敏及快速，成功應用于比格犬血漿中匹莫范色林的測定及其藥代動力學研究，為進一步研究匹莫范色林的藥理藥效、劑型改良及其臨床研究提供了實驗依據。

方法開發過程中，發現該化合物在系統中的殘留行為較為嚴重，為了降低殘留效應，將流動相中甲醇更換為乙腈，增強洗脫能力；嘗試不同洗脫能力的洗針液，分別為95%乙醇、異丙醇、混合溶液1(甲醇∶乙腈∶異丙醇∶水=1∶1∶1∶1，V∶V∶V∶V)、混合溶液2(甲醇∶乙腈∶異丙醇=1∶1∶1，V∶V∶V)，結果表明混合溶液2的洗脫能力較強，同時增加洗針程序中外洗時長，結果顯示，優化后的方法能夠有效控制殘留效應，確保了殘留不影響準確度和精密度。

考察了兩種不同的生物樣品前處理方法，蛋白沉淀法(PPT)和液液萃取法(LLE)。PPT法簡便、快速，但此方法獲得的生物樣品化合物響應較低不能滿足定量下限要求；而LLE法處理樣品干凈基質干擾少，且樣品經過濃縮后化合物響應較高，確保使用該方法測定血漿樣品時穩定、可靠。