IL-7及IL-15在腫瘤免疫療法中的應用

聶文冰，尹鴻萍

(中國藥科大學，江蘇 南京 211198)

嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T,CAR-T)療法是一種在體外分離患者T細胞后，利用慢病毒轉導或轉座子技術等對T細胞進行修飾，使其攜帶CAR基因，在回輸入患者體內后對腫瘤細胞進行識別并殺傷的技術。其發揮作用的關鍵在于CAR的設計。CAR主要包含3個部分：胞外抗原識別區ScFv，跨膜區以及胞內信號區。根據胞內信號結構域的不同，其又可分為4代[1-2]，一代CAR胞內部分只含有CD3-zeta結構域，修飾后T細胞擴增困難，體內實驗顯示其在小鼠體內的持久性較弱，因而療效不佳[3]；二代CAR中除了CD3-zeta結構域，額外含有一個共刺激結構域如CD28、4-1BB等，可顯著促進T細胞擴增；三代CAR中包含兩個共刺激結構域，CD28、4-1BB、OX40等；四代CAR將額外的分子原件如自殺基因，白介素基因等插入到CAR中一方面提高CAR的安全性，另一方面表達功能蛋白，使其更好地發揮作用[4]。目前CAR-T療法在血液瘤中包括急性B淋巴細胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤以及多發性骨髓瘤等的治療方面取得了顯著成效。然而其針對實體瘤的治療仍有待解決，主要是實體瘤中合適的靶點尋找受限、T細胞難以浸潤腫瘤部位以及腫瘤微環境的免疫抑制等原因引起[5]。

為了確保CAR-T的療效需要T細胞在體外能夠快速增殖。目前IL-2已經是公認的可促進T細胞增殖的細胞因子。在naive T細胞被激活后，效應T細胞可分泌IL-2并且增加IL-2受體的表達，從而促進T細胞的增殖。但是其本身對體內存在的naive T細胞以及memory T細胞的促增殖作用有限。在研究中，實驗者常常額外加入IL-7/IL-15來確保T細胞的增殖能力，本文主要就IL-7、IL-15促增殖作用的機制以及其在CAR-T免疫療法中的臨床應用進行綜述。

1 IL-7及IL-15的作用原理

1.1 IL-7的作用原理 人IL-7是一種由骨髓基質細胞分泌的，分子量為25 kDa左右的糖蛋白[6]。其基因長度為72 kb，位于染色體8q12～13上，由177個氨基酸構成。分子上含有3個糖基化位點，根據糖基化程度的不同，體外蛋白水平檢測時可于20、25、28 kDa左右出現3條蛋白條帶。IL-7的受體由高親和力受體α鏈(CD127)以及γc鏈(CD132)組成異二聚體[7-8]。

如圖1所示，當IL-7與其受體結合后，主要依賴兩條信號通路發揮作用：JAK-STAT通路以及pI3K-AKt通路[9-10]。經pI3K-AKt通路，IL-7一方面下調細胞周期相關抑制蛋白p27kipl的表達，另一方面促進周期蛋白cyclinD1的表達，從而促進細胞周期進展，誘導細胞增殖。另一方面，當IL-7與其受體結合后會導致胞質內JAK1及JAK3的激活，磷酸化STAT蛋白。磷酸化的STAT蛋白會形成異二聚體然后進入細胞核激活抗凋亡基因如Bcl-2和Mcl-1表達，抑制促凋亡蛋白如Bax和Bak等的表達，從而促進細胞存活。通過上述信號轉導，IL-7可促進自身Naive T細胞以及記憶T細胞的增殖，對CAR-T療法具有重要意義。

圖1 IL-7的信號通路圖

1.2 IL-15的作用原理 IL-15因子于1994年被Giri等[11]發現并命名，其編碼基因位于染色體4q31上，由162個氨基酸構成分子量為14～15 kDa的糖蛋白。其中48個氨基酸構成前導序列，114個氨基酸形成成熟的IL-15亞基。IL-15分子中含有2個二硫鍵以及2個糖基化位點使其構成4個α-螺旋束結構。IL-15的受體同IL-2一樣為異源三聚體，由IL-15Rα、IL-2/15Rβ及γc鏈組成。其是除IL-2外，唯一與IL-2共享受體β鏈的因子[12]。

如圖2所示，多數情況下IL-15與高親和力配體IL-15Rα結合形成復合物表達于多種細胞表面。當細胞被激活后，信號經IL-15/IL-15Rα反式遞呈到表達β/γc受體的效應細胞中，主要經JAK/STAT、pI3K-AKt以及MAPK 3條信號通路調節下游效應分子如Bcl-2、Bim、NF-κB、IFN-γ等發揮作用[13-15]。當JAKs被激活后，一方面促使STAT磷酸化入核，調節相關基因的轉錄與表達；另一方面，通過接頭蛋白Shc激活Grb2，Grb2既可作用于GAB2蛋白經pI3K-AKt通路促進細胞增殖及存活，又可與鳥嘌呤核苷酸交換因子SOS結合形成Grb2-SOS復合物經Ras-Raf途徑進一步激活MAPK來促進細胞增殖。與IL-7作用區別在于其主要經反式信號傳遞來發揮作用，從而促進記憶T細胞，特別是CD8+記憶T細胞的增殖。

圖2 IL-15的信號通路圖

2 IL-7及IL-15的體內外作用

2.1 促進CAR-T細胞的體內外增殖 Zhou等[16]利用一個攜帶eGFP標簽的anti-CD19 (4-1BB) CAR，轉導入T細胞后，比較其在不同因子IL-2或IL-7/IL-15共刺激條件下，細胞的增殖、凋亡以及抗腫瘤作用的差異。盡管IL-2組細胞在2周內可擴增100倍左右，但是經IL-7/IL-15共培養，細胞的擴增倍數約為IL-2組的2倍多。并且抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，細胞具有低凋亡率。此外有研究顯示在IL-2 (50 U·mL-1)中培養的T細胞從第20天開始細胞即有數量減少的趨勢，而在IL-7 (10 ng·mL-1)和IL-15 (10 ng·mL-1)中培養的T細胞在培養至35 d時仍有較好的擴增趨勢[17]。Hoyos等[18]將CAR-19+與自殺基因iC9、細胞因子IL-15共表達，構成一個新型的CAR載體，將其與常規的CAR19+相比較，每周以效靶比1∶2的比例用B細胞慢性淋巴性白血病CD19+刺激，共培養5周，作者發現構建的新型CAR體外擴增相較于CAR-19+增加10倍。此外，將CAR-T細胞經eGFP-FFLuc基因編輯后，經小鼠體內研究顯示攜帶IL-15的新型CAR-19+的擴增速度要優于CAR-19+3～15倍。

盡管在CAR-T研究中IL-2已有顯著的促增殖作用，但是其本身對部分T細胞的促增殖作用有限，通過與IL-7、IL-15聯合作用，可顯著提高整體CAR-T細胞的擴增速率，從而在確?；剌攧┝康臈l件下可縮短培養時間，一方面減少操作時間，更易確保產品的質量；另一方面保持CAR-T細胞的活性以達到最佳療效。

2.2 調節細胞表型，減弱細胞分化，促進存活 Xu等[19]比較了100 U·mL-1的IL-2與10 ng·mL-1的IL-7及5 ng·mL-1的IL-15培養條件下，CAR-T擴增后表型變化以及體內外抗B細胞惡性腫瘤的差異。研究者發現經IL-7/IL-15培養后，CAR-T終產品中CD8+CD45RA+CCR7+占比要明顯優于IL-2培養組(31%±4% vs 14%±5%)。Chen等[20]研究發現攜帶IL-15的GD2.CAR-T細胞與神經母細胞瘤CHLA255共孵育后與單純的GD2.CAR相比，可明顯增加IL-15的表達，并降低細胞分化水平，使TSCM/TCM細胞亞群占比較高(25%±11% vs 6%±2%,P<0.001)。并從轉錄水平上降低耗竭標記PD-1以及LAG-3的表達。因此可從體內外在無外源因子以及抗原刺激的條件下促進CAR-T增殖并延長其存活。Alizadeh的研究顯示，IL-15可通過降低mTORC1的活性使T細胞維持TSCM表型，促進細胞存活[21]。

在T細胞亞群中，盡管效應T細胞具有較強的細胞毒作用，而低分化的TN、TSCM、TCM細胞亞群在體內的存活時間更長，具有更佳的增殖潛力，對于CAR-T療效的持久性具有重要作用。在IL-2培養的條件下，T細胞的分化程度較高，盡管短時對腫瘤細胞的細胞毒作用優于IL-7/IL-15共培養組，但是其作用持久性較弱。IL-7、IL-15共培養條件下，可減弱細胞分化，增加TSCM以及TCM細胞的比例，從而延長CAR-T在體內生存期，對增加體內外抗腫瘤療效具有重要意義。

2.3 提高細胞毒作用 除了促進細胞增殖及存活外，IL-15還可通過增加穿孔素及顆粒酶的產生、促進產生IFN-γ及TNF-α等因子來增加淋巴細胞的細胞毒作用。Yao等[22]從健康招募者外周血內獲得雙陰性T細胞(DNTs)后在體外經5 μg·mL-1anti-CD3抗體激活后培養15～20 d。作者發現當DNTs額外用IL-15培養后，其可增加DNTs表面NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp44、顆粒酶B、穿孔素等表達，并促進IFN-γ及sTRAIL的分泌，從而增加體內外DNTs對腫瘤細胞的殺傷作用。此外，有研究顯示盡管IL-7/IL-15培養的CAR-T細胞與淋巴瘤細胞共孵育后對體外因子釋放以及細胞毒作用與IL-2組無顯著差異，但是小鼠模型顯示，輸注IL-7/IL-15 CAR-T細胞的小鼠抗腫瘤作用更強，并且小鼠的存活期更久[16]。因此相較于IL-2組，聯合IL-7、IL-15共培養的CAR-T細胞作用效果更佳。

3 IL-7及IL-15的臨床應用

關于IL-7/IL-15的臨床應用主要涉及兩個方面，一方面是在體外培養CAR-T的過程中外加IL-7及IL-15來考察CAR-T的療效；另一方面即在CAR設計過程中，直接將IL-7或IL-15與CAR的基因連接，形成一個嵌合抗原受體后來評估其療效。在重慶新橋醫院開展的一項臨床試驗通過IL-7/IL-15體外培養來替換原來的IL-2培養，旨在判斷輸注淋巴瘤患者后，IL-7/IL-15培養的抗CD19 CAR-T細胞是否能在體內持續更長的時間，以及CAR-T細胞的持久性是否可以提高抗淋巴瘤的療效。錢文斌等通過2A肽段將IL-7以及趨化因子CCL19與CD19.CAR構建成新的嵌合抗原受體，用于治療B細胞淋巴瘤。同樣的，在溫州醫科大學第六附屬醫院開展的一項臨床實驗也利用四代CAR (含IL-7/CCL19/IL-21)用于治療Nectin-4/FAP高表達的實體瘤。一項關于 iC9.GD2.CAR.IL-15 T細胞治療復發/難治性神經母細胞瘤的Ⅰ期臨床試驗也正在北卡萊茵伯格綜合癌癥中心展開。

通過表1所示這些臨床試驗，根據患者輸注后的應答情況可以直觀的考察IL-7/IL-15與CAR-T聯用后，CAR-T免疫療法的療效是否得到顯著提升，從而更好地為患者帶來福音。

表1 IL-7/IL-15在CAR-T免疫療法中的臨床應用

4 結語

迄今為止，CAR-T療法在腫瘤治療領域方興未艾，截至目前共有429項涉及不同種類腫瘤、不同靶點的CAR-T臨床項目在全球展開，我國多家醫療企業、機構也在開展多項針對不同腫瘤的CAR-T臨床試驗，而IL-7及IL-15因子已顯示出對CAR-T優異的促增殖作用，可使CAR-T減弱分化表型，延長體內存活，增加其療效。在體外培養過程中將IL-7/IL-15替代IL-2；或與IL-2連用；或者在CAR的設計過程中加入IL-7/IL-15基因均有利于CAR-T療效。然而IL-7及IL-15因子對CAR-T療法的療效針對患者而言具體有多大的提升作用還需要臨床試驗數據來進一步支撐。