蘋果Actin基因片段克隆及序列分析

秦子禹， 張向昆， 王 娜， 項殿芳

(河北科技師范學院園藝科技學院，河北昌黎 066600)

在植物基因表達研究中，通常需要引入內參基因來矯正系統誤差。常用的內參基因有肌動蛋白基因(Actin)、微管蛋白基因(Tubulin)、泛素基因(Ubiquitin)、18SrRNA、組蛋白基因(Histone)等。肌動蛋白(Actin)是普遍存在于真核生物中的一種蛋白質，也是細胞骨架的重要組成成分，它主要參與細胞的變形運動、胞吞與胞吐、細胞分裂、花粉管生長、細胞內物質運輸、細胞形狀變化、細胞內信號轉導以及基因表達與調控等過程[1-3]。此外，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上具有高度的保守性和同源性，據此可將其用于研究不同物種之間的親緣關系和分化時間[4-5]。目前，已經成功克隆了鴨梨[6]、葡萄[7]、棗[8]、火龍果[9]、香蕉[10]等果樹的Actin基因。

蘋果是世界四大水果之一，也是我國栽培面積和產量最大的果樹[11]。近年來，探究蘋果矮化、抗逆性、果實品質形成等方面的分子機制成為研究熱點，而尋找到穩定的內參基因是開展相關研究的必備條件之一。鑒于Actin基因的保守性，且已被作為內參基因成功應用在不同作物的分子生物學研究中[12-14]，本研究以我國栽培面積最大的紅富士蘋果的葉片為材料，采用反轉錄PCR(reverse transcriptase PCR，RT-PCR)方法，對蘋果Actin基因片段進行克隆和生物信息學分析，旨在為深入研究Actin基因的結構和功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑和儀器

紅富士蘋果葉片采自河北科技師范學院園藝科技學院試驗站(119.17°E，39.70°N)。

RNAiso Plus、RNAiso-mate、Recombinant DNase Ⅰ 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒及pEASY-T3Cloning Kit購自北京全式金生物技術有限公司；2×ESTaqMasterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

Bio-Rad S1000 PCR儀、凝膠成像系統Universal Hood Ⅱ為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 通過比對GenBank中已發表的高等植物肌動蛋白基因(Actin)的核苷酸序列，找到保守區域，采用Primer Premier 5.0軟件設計擴增引物，將上游引物標記為Act-sta-F：TGGTGAAGGCTGGATTTGCT；下游引物標記為Act-sta-R：GACTCGTCATACTCACCCTTGG，預期擴增產物長度為1 048 bp，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 稱取0.1 g蘋果葉片，利用RNAiso Plus、RNAiso-mate試劑盒，按照試劑盒說明書提取總RNA。再利用Recombinant DNaseI試劑盒對得到的總RNA進行純化，然后以Oligo(dT)18為引物采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行反轉錄合成cDNA。

1.2.3Actin基因的PCR擴增 以Act-sta-F、Act-sta-R 為引物，以蘋果葉片cDNA為模版進行Actin基因的PCR擴增。擴增體系為cDNA模板 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×ESTaqMasterMix 12.5 μL，RNase-free Water 9.5 μL，共計25 μL。反應條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃ 再延伸5 min。

1.2.4Actin基因的克隆與鑒定 PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統中觀察到符合預期大小(1 000 bp左右)的目標片段，利用DNA凝膠回收試劑盒對其進行切膠回收并純化后連接到pEASY-T3載體上，轉化至EscherichiacoliDH5α感受態細胞中，于37 ℃下在含有氨芐青霉素、X-gal、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養基上培養8～14后，挑取陽性單克隆菌落進行增菌培養，用質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒，并進行PCR擴增和酶切鑒定，同時送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

將測序結果在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行BLAST同源性分析及保守域查找，然后利用DNAMAN8、MEGA5軟件對克隆序列進行氨基酸保守性分析，并構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 Actin基因的克隆

以從蘋果葉片中提取的總RNA為模板，進行反轉錄合成cDNA后，利用引物Act-sta-F、Act-sta-R進行PCR擴增，獲得1條長度為1 000 bp左右的基因片段(圖1)，與預期大小相符。將其回收純化后，連接到pEASY-T3載體上，轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，按照“1.2.4”節中的方法培養后，挑取陽性單克隆菌落進行增菌培養，用質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒后，進行PCR擴增和酶切鑒定，均得到長度為1 000 bp左右的特異片段(圖2、圖3)，表明該基因片段已被成功克隆，可以進行測序。

2.2 Actin基因的測序結果及序列分析

測序結果(圖4)表明，本研究克隆的基因片段長度為1 048 bp。通過BLAST軟件搜索比對發現，該序列與其他植物的Actin基因具有高度同源性，其中與白梨(Pyrusxbretschneideri)的同源性高達99%(圖5)，與核果類果樹桃(Prunuspersica)、中國李(Prunussalicina)和歐洲甜櫻桃(Prunusavium)的同源性均為94%，與棗(Ziziphusjujube)的同源性為90%，表明克隆得到的基因片段為Actin基因的一部分，將其命名為MdActin1。

通過DNAMAN8軟件將該片段翻譯成氨基酸序列，并利用NCBI網站上的BLAST程序對其進行比對分析。結果(圖4)顯示，該序列編碼348個氨基酸，包括338個保守氨基酸，而非保守氨基酸僅為10個，與其他植物肌動蛋白的氨基酸同源性達97%以上，表明該序列在氨基酸水平上高度保守。對MdActin1蛋白進行功能保守域分析， 結果(圖5)顯示，其同時含有NBDsugarkinase、HSP70、actin superfamily特異性標簽，說明MdActin1蛋白為Actin蛋白超家族成員之一。

選取經BLAST分析得出的同源性高的氨基酸序列，利用MEGA5構建系統進化樹，結果(圖6)顯示，MdActin1蛋白與白梨Actin蛋白(登錄號：NP_001289215.1)親緣關系最近，其次為榴蓮Actin蛋白(XP_022774869.1)，與番茄Actin蛋白(登錄號：NP_001295376.1)親緣關系最遠。

3 討論與結論

高等植物肌動蛋白是由單一多肽鏈構成的球狀蛋白，包含有375～377個氨基酸，廣泛分布于植物的各種組織器官中，且所有植物的肌動蛋白均起源于一個共同祖先[15]。植物Actin基因在進化上極為保守，其堿基替換率非常低，為每1億年替換1%，因此常將其用于分析物種進化和鑒別物種間的親緣關系[16]。此外，也常被作為內參基因用于基因表達研究[12-14]。

本研究中克隆的紅富士蘋果葉片Actin基因序列與白梨Actin基因的同源性高達99%，與核果類果樹桃、中國李和歐洲甜櫻桃Actin基因的同源性均為94%，與棗Actin基因的同源性為90%，充分證明蘋果Actin基因與其他植物Actin基因具有較高的同源性。此外，在其編碼的氨基酸序列中，保守氨基酸數量為338個，而非保守氨基酸僅為10個，與其他植物肌動蛋白同源性達97%以上，表明該序列在氨基酸水平上也是高度保守的。該研究結果不僅可豐富高等植物Actin基因的核酸數據庫，還可為進一步深入研究植物Actin基因的功能并將其作為內參基因應用于蘋果基因表達研究中提供依據。