沃柑SSR分子標記篩選及其在品種鑒定上的應用

黃其椿， 盧東長城， 陳東奎， 江 東， 劉吉敏， 謝 健， 施平麗， 張 蘭， 劉福平

(1.廣西農業科學院園藝研究所，南寧 530007； 2.南寧維爾凱生物科技有限公司，南寧 530022；3.中國農業科學院柑桔研究所，重慶 400712； 4.廣西農業科學院植物保護研究所，南寧 530007)

柑橘是全球種植面積最大和總產量最高的水果之一。中國是柑橘的起源中心之一，柑橘種質資源豐富。雜交選育是柑橘育種的重要策略，也造成了柑橘品種的高度遺傳雜合性。近20年來，柑橘新品種主要來源于芽變選育[1-2]。芽變選育得到的新品種大部分性狀來自原品種。近年通過引種和育種，使中國柑橘品種更加多樣化。在鑒別柑橘品種上，雖然可通過枝葉形態等鑒定柑橘品種，但是形態學標記較少，特別在苗期時，由于營養、日照等環境因素影響葉片沒有完全展開，有時難以進行品種鑒定。沃柑(Orah)是坦普爾柑橙與丹西紅橘雜交的晚熟柑橘品種[3]，由于經濟效益顯著，近年來在廣西、重慶、四川、云南等地快速推廣，種植面積超過15.0萬hm2[4]。隨著種植面積的快速增加，如何確保沃柑品種的純正，保證種苗的質量，加強種苗的檢測工作變得更為重要。隨著分子生物學的發展，SSR(simple sequence repeat)分子標記鑒定因快速準確，不受時間、環境條件影響等優點逐漸發揮重要作用，能夠滿足沃柑育苗的要求。DNA分子標記技術廣泛應用于植物遺傳多樣性和種質鑒定中，其中常用的技術包括SSR、AFLP、RAPD、SNP等已應用于柑橘品種鑒定[5-8]。SSR分子標記的發展歷史長，應用簡易方便，為共顯性分子標記，具有多態性豐富和PCR擴增結果重現性高的優點，被認為是研究群體遺傳變異最好的標記之一[9]。劉通等利用SSR和SRAP分子對34份廣西野生柑橘種質和地方品種進行遺傳多樣性分析[10]。李益等用503份種質經過多輪篩選出21個SSR標記[11]。曾濤利用SSR 分子標記構建了南豐蜜橘的指紋圖譜并分析了各南豐蜜橘的遺傳多樣性[12]。劉召亮等應用SSR分子標記對江西各金沙柚主栽區的金沙柚及相關近緣種質進行分析，為金沙柚品種的鑒定、保存和評價等提供參考[13]。目前，國內沃柑SSR分子標記研究未見報道，生產上應用較少。本研究通過篩選SSR分子標記，可在不同時期、不同地塊的多種柑橘品種中準確鑒定出沃柑，準確率100%，為SSR分子標記應用于沃柑的品種鑒定打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

第一批柑橘標樣(Ⅰ)于2018年9月27日在廣西農業科學院本部采集(記錄好編號和品種)。第二批柑橘樣品(Ⅱ)于2019年1月25日在廣西農業科學院本部采集(第二、三、四批采集的樣品由采集人記錄好編號和品種。不告知檢測人員品種信息)。第三批柑橘樣品(Ⅲ)于2019年2月23日在廣西農業科學院里建科研基地的柑橘采穗圃采集。第四批柑橘樣品(Ⅳ)于2019年2月23日在廣西農業科學院里建科研基地的柑橘觀察圃和示范園采集。樣品信息詳見表1。成熟期剪取+1葉，4 ℃冰箱保存，采樣后3 d內完成DNA提取。

1.2 DNA提取

每個樣品取適量葉片，超純水沖洗干凈，晾干。剪取約0.1 g置于干凈的2 mL EP管中，加入 800 μL CTAB后用組織研磨儀研磨。混勻，65 ℃水浴預熱40～60 min，每隔10 min振蕩混勻1次。12 000 r/min 離心5 min，吸取上清轉入新的2 mL離心管中，按照1 ∶1加入氯仿劇烈振蕩混勻，室溫放置10 min。12 000 r/min離心10 min，吸取上清。加入1/10的3 mol/L NaAc和2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗2遍，晾干。100～400 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存。

1.3 柑橘SSR檢測

使用李益等報道的SSR引物[14]，這些SSR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列見表2。

表1 用于沃柑SSR分子標記檢測的柑橘材料

表2 SSR引物編號及序列

PCR反應體系為：10×PCR buffer 2 μL；Mg2+(25 mmol/L) 2 μL；dNTP(10 mmol/L) 0.4 μL；引物F(0.5 μmol/L/μL) 1 μL；引物R(0.5 μmol/μL) 1 μL；TaqDNA Polymerase (5 U) 0.2 μL；模板 gDNA(25 ng/μL) 2 μL；用ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序為： 94 ℃ 預變性5 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 延伸 10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 多態性分析

使用標品檢測3對SSR引物的多態性時，每對引物均要檢測到5條以上條帶。在1%瓊脂糖凝膠電泳圖中，3對SSR引物擴增產物可清晰區分沃柑、少核茂谷柑、茂谷柑、華晚無籽沙糖橘、貢柑5個品種，但沃柑與無核沃柑SSR引物擴增產物之間未見顯著差異(圖1)。

2.2 多樣本檢驗

為進一步檢驗這3個SSR分子標記在沃柑育苗、生產中的可靠性，在不同時期、不同地點取樣，并增加更多的品種類型，進行SSR分子標記檢測。結果發現，根據這3個SSR分子標記的檢測結果(圖2)，可在16個品種(沃柑、無核沃柑、少核茂谷柑、茂谷柑、華晚無籽沙糖橘、貢柑、愛媛38、晚血8號、瀨戶水、明日見、長葉香橙、清秋臍橙、紐荷爾臍橙、甘平、大雅1號、紅肉臍橙)中準確、有效地檢測到沃柑和無核沃柑，準確率達到了100%(表3)。

3 討論

沃柑是坦普爾柑橙與丹西紅橘雜交的晚熟柑橘品種。無核沃柑是由γ射線輻射誘變育成的沃柑新品種，在保留了沃柑生長勢強、高糖、肉脆、多汁、味濃、越冬落果少、成熟后掛樹期長等優點的同時，克服了普通沃柑多籽的缺點。由于經濟效益顯著，近年來在廣西、重慶、四川、云南等地，沃柑和無核沃柑得到快速推廣。沃柑和無核沃柑從苗期到掛果需要2～3年時間，期間需要大量人力和財力投入。如不能有效鑒定沃柑種苗，一旦種植到假苗將對果農造成巨大的經濟損失。

表3 根據檢測結果判斷是否為沃柑

本研究使用的3個SSR分子標記可以準確有效地從16個不同的廣西、重慶、四川種植的主要柑橘品種中篩選出沃柑和無核沃柑，但因沃柑和無核沃柑的SSR條帶沒有差異，因此無法區分沃柑和無核沃柑。無核沃柑是由γ射線輻射誘變育成的沃柑新品種，其遺傳背景與沃柑非常相似，目前暫未見可有效區別這2個品種的分子標記的相關報道。目前沃柑和無核沃柑在廣西的種植表現和經濟收益都較高，因此即便本研究使用的SSR分子標記無法區分無核沃柑和沃柑，但有效地從多種柑橘品種中區分出無核沃柑和沃柑，在生產實踐中仍然具有應用價值。

本研究中使用低分辨率的瓊脂糖電泳仍可以有效地篩選出沃柑和無核沃柑。由于與毛細管電泳相比，瓊脂糖電泳對實驗室設備要求不高，而與聚丙烯胺電泳相比，瓊脂糖電泳更快速便利，因此低分辨率的瓊脂糖電泳可作為沃柑品種鑒定和雜交選育新品種中SSR分子標記篩選的有效而經濟的實驗技術。另一方面，隨著基因組測序技術的發展，簡化基因組測序成本大大降低，開發更新一代的SNP分子，有希望更準確高效地廣泛篩選柑橘品種，包括有效區分近緣品種(如沃柑和無核沃柑)。