湖南48個水稻栽培品種抗瘟性評價及抗性基因鑒定

賀 雄， 丁朝輝， 胡立冬， 任佐華， 周 瑚，3， 朱華珺，3， 李俊俊， 丁宇倩， 戴良英，3， 劉二明，3

(1.湖南農業大學植物保護學院/植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；2.湖南省桃江縣農業局，湖南益陽 413400；3.南方糧油作物協同創新中心，湖南長沙 410128)

水稻稻瘟病是由稻梨孢絲狀真菌(有性態為Magnaportheoryzae，無性態為Pyriculariaoryzae)侵染引起，是一種水稻災害性病害[1]。選育和推廣高效的抗病品種，是防治稻瘟病最經濟、最有效、最安全的方法[2]。選育和推廣抗病品種，不僅對稻瘟病有優良的防治效果，而且能減少化學農藥的使用，降低生產成本，減少壞境污染；但是，同一個抗病品種大面積種植所形成的選擇壓極易導致稻瘟病菌發生變異，產生新的生理小種，從而使推廣的水稻抗病品種在3～5年就可能喪失抗病性[2-3]。因此，不斷監測稻瘟病菌的變異程度與水稻抗性品種的抗病性，及時篩選新的抗性品種對稻瘟病的防治十分重要[4]。

稻瘟病菌與水稻品種之間的特異性互作符合Flor的“基因對基因”假說[5]。本研究利用10株具有代表性的已知無毒基因的稻瘟病菌單孢菌株，對湖南種植的48個水稻品種進行抗瘟性評價和抗瘟基因型進行初步鑒定，以期為湖南水稻栽培品種合理布局防控稻瘟病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2017年于湖南省桃江縣稻瘟病病圃采集多個水稻品種稻瘟病樣，通過多倍變焦體視顯微鏡挑取單孢，分離得到49個稻瘟病單孢菌株后經無毒基因鑒定篩選出具有代表性的菌株10株(表1)。

1.2 供試水稻

供試水稻共48個品種(由湖南省益陽市桃江縣植保站統一收集提供)，對照為筆者所在課題組繁殖的高感品種麗江新團黑谷(LTH)(表2)。

1.3 孢懸液制備及水稻育苗

利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基將保藏于高粱粒中的稻瘟病菌單孢菌株活化后，再將其接種到番茄燕麥培養基上，于培養箱中28 ℃光暗交替培養(光—暗周期為12 h—12 h)，待稻瘟病菌菌絲長滿整個平板后，加入1 mL無菌水，用滅菌棉棒將表面菌絲刮斷，再用移液槍將洗脫的菌液轉移到新的番茄燕麥培養基上，并用涂布器涂布均勻，28 ℃培養至新的番茄燕麥培養基平板上長滿菌絲，再用含0.1% Tween-20 的無菌水洗脫孢子，并利用血球計數板將孢懸液的孢子濃度調節至2×105個/mL，供接種使用[6]。

表1 10株供試菌株包含的無毒基因

表2 48個供試水稻品種及對照

表2(續)

水稻育苗土壤為肥沃的稻田土，置于育苗盤(30 cm×20 cm×7 cm)備用。種子在室溫下用清水浸泡24 h，瀝干水分再置于恒溫箱32 ℃催芽12 h至種子破胸露白，28～30 ℃催芽24 h，至芽長約 0.2 cm，播種到育苗盤；在秧苗1葉1心、3葉1心、接種前3 d各追施尿素1次，每次每盤施尿素1 g。

1.4 離體接種

當水稻苗長至5葉期，剪取葉片，進行針刺離體接種[6]。接種后的稻苗置于28 ℃、濕度為95%的環境中暗處理24 h，隨后光暗交替(光—暗周期為12 h—12 h)培養，期間隨時觀察發病情況，4～6 d后記錄發病情況。

1.5 數據統計

稻瘟病菌群體的毒力頻率(virulence frequency，VF)=對測試水稻品種有毒力的菌株數/所有菌種菌株數×100%；當VF≥70%時病菌群體表現強毒力，50%≤VF<70%時為較強毒力，20%≤VF<50%時為中等毒力，VF<20%時為弱毒力[7]。

接種葉片上僅有黑褐色壞死斑或沒有病斑時為抗病反應型；當病斑中央灰褐色、病斑比較大并有黃色發病圈時為感病反應型。通過數據分析軟件DPS 7.05，利用0-1 Nei & Li最長聚類法進行聚類分析[8]。并根據10株菌株對已知抗性基因的24個近等基因系水稻品種的接種鑒定結果，對供試水稻品種進行抗瘟基因的推導與分析。

2 結果與分析

2.1 10株稻瘟病單孢菌株對48個水稻品種的毒力分析

利用已明確其無毒基因的10株稻瘟病單孢菌株對48個水稻品種進行苗期離體接種試驗。結果表明，10株供試菌株接種于48個不同水稻品種后，各品種表現出的抗病能力存在較大差異，其對應的毒力頻率在0～60%之間(表3)。在48個水稻品種中，表現出較強毒力的品種有豐兩優4號(VF=60%)、粵禾絲苗(VF=50%)、隆兩優534(VF=50%)，以上3個品種抗譜窄，在湖南地區種植抗稻瘟病效果較差，應避免在湖南稻瘟病多發地區種植；有34個水稻品種毒力頻率為中等毒力(20%≤VF<50%)，占試驗總數的70.83%，此34個水稻品種抗譜較廣，抗稻瘟病效果一般，具有一定的抗病能力，但是隨著時間的推移，有抗病能力衰減甚至喪失的風險，應慎重使用；屬弱毒力(VF<20%)的水稻品種共有11個，占試驗總數的22.92%，其中徽兩優882、豐兩優香1號毒力頻率甚至低至0，這種現象可能是由于本試驗菌株數量太少造成，此11個水稻品種抗性基因譜寬，抗病效果強，可結合水稻品種產量、氣候等各方面因素進行推廣種植。

表3 10株稻瘟病菌株對48個水稻品種的毒力頻率

2.2 48個供試水稻品種抗瘟基因型分類

根據48個水稻品種與10株已知無毒基因的稻瘟病菌株的親和反應類型結果，利用DPS 7.05數據軟件建立0-1數據庫，并通過0-1 Nei & Li最長聚類法進行聚類分析。結果表明，在相似系數0.70，即差異系數0.30水平上，可將48個水稻品種劃分為31類(圖1)。

統計每一類別內水稻品種表現抗性所關聯的菌株，從而推導出供試水稻品種所含有的抗瘟基因譜(表4)，結果表明，本試驗的48個供試品種抗病性都比較強(圖2)，抗瘟基因Pi-1、Pi-a、Pi-7、Pi-3、Pi-i、Pi-11、Pi-19等普遍存在于各水稻譜系中，出現頻率高；Pi-5、Pi-t、Pi-kp抗瘟基因出現頻率比較低；抗性基因Pi-ta出現頻率最低。

表4 48個水稻品種抗性基因類別推定

表4(續)

3 討論與結論

實踐證明控制水稻稻瘟病最經濟有效的手段就是選育和利用抗病品種。近年來，我國各地區、各級種子管理和評審部門對參試水稻品系的稻瘟病抗性嚴格把控，使得新審定品種均能在中抗以上水平上得到改善[9]。但由于稻瘟病生理小種多、變化速度快、致病力差異大等原因，新品種在推廣種植3～5年后，抗性就會逐漸喪失[10]。

本研究利用10株已知所含無毒基因的稻瘟病單孢菌株對湖南稻區栽培的48個水稻品種進行稻瘟病抗性鑒定，表現高抗水平的品種有11個，分別是徽兩優882、吉優353、榮優390、T優259、益優701、兩優6206、徽兩優絲苗、豐兩優香1號、湘兩優143、N兩優2號、創兩優茉莉占，中等抗病品種34個，感病品種3個。農技部門在篩選主導品種時，應結合最新的鑒定結果，重點推廣農藝性狀較好的中、高抗稻瘟病水稻品種。

水稻中存在著一類編碼NBS-LRR蛋白(nucleotide binding site-leucine-rich repeats)的主效抗稻瘟病基因， 這類抗病基因介導的抗性表現強烈，傳統意義上稱之為垂直抗性[11]。在育種應用上，抗性基因可操作性強、效果明顯，因此開展主效抗性基因的鑒定及其應用研究較多。隨著抗性基因數量的增加，供試材料的抗病性呈上升趨勢。品種抗瘟能力與其抗稻瘟病基因型種類密切相關，不同的抗病基因型能針對不同的生理小種產生抗稻瘟病反應[12]。

大量與水稻稻瘟病鑒定與抗性基因型的推定研究當中，李剛等利用14個菌株鑒定江蘇省49個水稻品種抗性基因，抗性基因Pi-a、Pi-k的出現頻率比較高，達到將近80%[13]。宋兆強等利用抗瘟基因Pi-b、Pi-ta、Pi-54和Pi-km的功能標記檢測了60個育種資源，得出Pi-b、Pi-ta在各水稻品種中出現的頻率雖然比較高，但是該抗瘟基因抗性逐漸在減弱[14]。周瑚等利用16株含已知無毒基因的稻瘟病單孢菌株對湖南地區栽培的50個水稻品種進行了稻瘟病抗性鑒定，結果表明，出現頻率最高的抗性基因為Pi-k和Pi-20，其次為Pi-t、Pi-ta、Pi-z和Pi-3；抗瘟基因Pi-5和Pi-19的出現頻率低于20%[15]。

本研究基于2018年湖南稻區多個水稻品種分離的稻瘟病菌株鑒定主要抗瘟基因，其中Pi-5、Pi-t、Pi-kp等抗瘟基因出現頻率稍低，抗瘟基因Pi-ta出現頻率最低；主要體現在金兩優383、T兩優168、中早-39、豐兩優四號、荊兩優1189這些水稻品種的抗性基因缺失，導致抗瘟性差，選育時應慎重。杜太宗等在對Pi1、Pi9聯合抗病性的研究中發現，抗性基因Pi1、Pi9二者共同作用，能夠抵抗單個抗病基因不能抵抗的生理小種，拓寬抗譜，提高水稻抗病性[16]。未來在進行抗稻瘟病育種時，可把多個抗病基因聚合在一起，這將是獲得持久、高抗稻瘟病品種的重要途徑之一。