嘉寶果果皮提取物不同極性部位抗氧化活性研究

林寶妹， 洪佳敏， 邱珊蓮， 鄭開斌， 張 帥

(福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建漳州 363005)

嘉寶果(MyrciariacaulifloraBerg.)，又名珍寶果、樹葡萄、擬愛神木，為桃金娘科(Myrtaceae)擬愛神木屬(Myrciaria)常綠灌木，是原產(chǎn)巴西的一種常見果樹，現(xiàn)在我國臺灣省、福建省、廣東省等多個地區(qū)均有種植[5]。果實營養(yǎng)成分豐富，富含多種維生素及微量元素，例如維生素B2、抗壞血酸(維生素C)、鋅、鈣、鐵等[6]。果皮富含花青素、單寧、黃酮醇等酚類化合物，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、消炎、抗菌等多種生物活性[7-10]。目前已有多種嘉寶果果實加工品如果酒、果醬、果脯等在售，市場前景較好。目前對嘉寶果果皮抗氧化活性的研究主要是果皮粗提物或者直接應用果皮凍干粉，而對果皮粗提物的分離及抗氧化活性組分進行篩選的研究較少。本研究采用不同極性的有機溶劑對嘉寶果果皮提取物進行分級，通過測定總多酚含量并以清除DPPH·自由基、ABTS+自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基對各極性部位的抗氧化性進行評價，為嘉寶果果皮的研究與利用提供理論基礎與方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嘉寶果成熟果實采自福建省龍海市惠昌嘉寶果專業(yè)合作社，供試嘉寶果品種為“沙巴”。

1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：L5S型，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)；超純水機：UPW-20N型，北京歷元電子儀器有限公司生產(chǎn)；分析天平：BS110S型，德國Sartorius集團生產(chǎn)；粉碎機：WBL2521H型，佛山美的集團生產(chǎn)；數(shù)控超聲波清洗儀：KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；冷凍高速離心機：MIKRO-22R型，德國Hettich生產(chǎn)；臺式冷凍恒溫振蕩儀，THZ-C-1型，蘇州培英實驗設備有限公司生產(chǎn)；旋轉蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。

1.3 嘉寶果果皮提取物不同極性部位制備

1.3.1 嘉寶果果皮提取物制備 嘉寶果成熟果實去籽和果肉→嘉寶果果皮→60 ℃烘干至恒質量→粉碎，過40目篩→提取溶劑70%乙醇、料液比 1 g ∶60 mL、28 ℃、180 r/min振蕩提取20 h→28 ℃、120 W超聲波提取20 min→8 000 r/min離心15 min→取上清液待用。

1.3.2 不同極性部位制備 取“1.3.1”節(jié)制備的提取液→50 ℃旋轉蒸發(fā)儀旋蒸至無醇味→以超純水稀釋濃縮液至原提取液體積→依次以乙酸乙酯、正丁醇按照1 ∶1體積比萃取3次→合并萃取液→40～65 ℃ 旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑→獲得乙酸乙酯相、正丁醇相以及萃取后剩下的水相，重新溶解各極性部位，以原材料質量濃度表示各極性部位質量濃度，單位為mg/mL。

1.4 總多酚含量測定

參考Wang等的福林酚法[11]，并修改如下：將不同極性部位提取物用超純水稀釋成10 mg/mL，取0.1 mL樣品于試管中，再加入0.1 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu試劑和2.8 mL水，混勻，靜置8 min后加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，搖勻，室溫下密封避光2 h，于765 nm處測吸光度，試驗重復3次。按照上述方法，以沒食子酸為標準品，以沒食子酸質量濃度為x軸，吸光度為y軸，繪制回歸曲線。不同極性部位提取物的總多酚含量以1 g原材料含有的沒食子酸質量計，單位為mg/g。

1.5 抗氧化能力測定

1.5.1 DPPH·清除能力 參照Tang等的方法[12]并稍作修改，具體如下：分別取0.5 mL樣品于試管中，再加4.5 mL 0.13 mmol/L DPPH·的95%乙醇溶液，搖勻后置于暗處反應30 min，于 517 nm 處測定吸光度D1；同時設置空白對照組D0(以超純水代替樣品)和樣品本底組D2(以95%乙醇代替DPPH·溶液)，試驗重復3次，求其平均值，計算DPPH·清除率。按照上述方法測定維生素C對DPPH·的清除率。

DPPH·清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

1.5.2 ABTS+清除能力 參照Seczyk等的方法[13]并稍作修改：配制ABTS+反應工作液，7 mmol/L ABTS+與2.45 mmol/L過硫酸銨等體積混合，暗處靜置12 h，以95%乙醇稀釋至吸光度為0.7±0.05，為反應工作液。取0.1 mL樣品于試管中，加入 3.8 mL ABTS+反應工作液，搖勻后置于暗處反應 6 min，于734 nm處測定吸光度D1，同時設置空白對照組D0(以超純水代替樣品)和樣品本底組D2(以95%乙醇代替ABTS+反應工作液)，試驗重復3次，求其平均值，計算ABTS+清除率。按照上述方法測定維生素C對ABTS+的清除率。

ABTS+清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

1.5.3 ·OH清除能力 參考劉曉飛等的方法[14]，并稍作修改，具體如下：2 mL pH值7.4的磷酸鹽緩沖液和0.5 mmol/L鄰二氮菲70%乙醇溶液、0.5 mmol/L 硫酸亞鐵、樣品各1 mL依次加入試管中，再加入1 mL 0.1%過氧化氫溶液，于37 ℃水浴中反應1 h，反應結束后于510 nm處測定吸光度D1，同時設置損傷組D2(以超純水代替樣品)、未損傷組(以超純水代替過氧化氫溶液和樣品)D0，樣品本底組D3(以超純水代替反應試劑)試驗重復3次，求其平均值，計算·OH清除率。按照上述方法測定維生素C對·OH的清除率。

·OH清除率=[1-(D1-D2-D3)/(D0-D2)]×100%。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行回歸曲線的制作；采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

以不同質量濃度沒食子酸測得的吸光度建立回歸方程：y=1.668x+0.079(r2=0.995 5)，由圖1可見，沒食子酸在質量濃度0.100～0.500 mg/mL 內與吸光度有良好的線性關系。

2.2 果皮提取物不同極性部位總多酚含量

由圖2可見，嘉寶果果皮粗提液不同極性部位總多酚含量在5.895～41.287 mg/g，其含量從高到低依次為乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位，乙酸乙酯部位和正丁醇部位的總多酚含量較為接近，乙酸乙酯部位總多酚含量為(41.287±0.421) mg/g，正丁醇部位的總多酚含量為(36.211±0.240) mg/g，水部位含量最低，為(5.895±0.092) mg/g，水部位僅約為乙酸乙酯部位多酚含量的1/8。

2.3 果皮提取物不同極性部位抗氧化能力

2.3.1 DPPH·、ABTS+、·OH清除能力 由圖3、圖4、圖5、表1可知，在試驗的濃度范圍內，果皮提取物各極性部位對DPPH·、ABTS+、·OH等3種自由基的清除作用隨著提取物濃度的增加而增強，二者呈線性關系，r2>0.98。且各極性部位對以上3種自由基的清除能力相差較小，回歸曲線斜率相近，EC50值較為接近，但仍有以下區(qū)別：正丁醇部位和乙酸乙酯部位對DPPH·、ABTS+、·OH 自由基的清除能力大小順序依次均為DPPH·>ABTS+>·OH，而水部位對以上自由基的清除能力大小順序為DPPH·>·OH>ABTS+，即水部位清除·OH的能力大于清除ABTS+。清除DPPH·、ABTS+、·OH 自由基能力大小依次為乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位。表1、表2結果表明，抗氧化劑(維生素C)對DPPH·和ABTS+自由基的清除能力大于各極性部位，但清除·OH自由基的能力弱于乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

表1 嘉寶果果皮提取物不同極性部位自由基清除效果的比較

注：―表示在試驗條件下未測得。

表2 維生素C清除 等4種自由基效果的比較

2.4 抗氧化與總多酚含量的相關性

表3 抗氧化與總多酚含量的相關性

注：*表示達顯著相關(P<0.05)；**表示達極顯著相關(P<0.01)。

3 討論與結論

正常情況下人體內自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡中。適當數(shù)量的自由基不但對人體無害，而且參與體內能量傳遞、炎癥消除、抑制腫瘤等重要過程。自由基的數(shù)量過多，會破壞機體細胞結構，引起脂質過氧化，干擾正常代謝活動，與糖尿病、心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關[16-17]。除機體自身的自由基清除系統(tǒng)如抗氧化酶、維生素、激素等，許多天然產(chǎn)物中富含的小分子如維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素以及各種多酚等均能有效清除自由基，幫助人體抵御過量自由基造成的危害，對這些天然產(chǎn)物進行抗氧化功能評價，有利于天然抗氧化劑的開發(fā)應用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，嘉寶果果皮醇提取物能有效清除DPPH·、·OH及ABTS+等自由基，表現(xiàn)出較好的抗氧化性，但未對果皮醇提取物進行分部位有效性研究。

本研究以嘉寶果果皮為原料，以不同極性有機溶劑依次萃取果皮醇提取物獲得提取物乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。通過4種不同方法檢測各極性部位的抗氧化活性并測定其多酚含量，結果發(fā)現(xiàn)，各極性部位中以乙酸乙酯部位抗氧化活性最強，總多酚含量最高，清除·OH的能力甚至超過了維生素C，表現(xiàn)出極強的羥自由基清除能力，具有抗氧化劑開發(fā)價值。本研究結果可為今后嘉寶果果皮多酚的開發(fā)利用提供一定的參考。