能夠快速固定重金屬的復合發(fā)酵菌液的制備及應用

劉亞平

(河北省地質環(huán)境監(jiān)測院/河北省地質資源環(huán)境監(jiān)測與保護重點實驗室，河北石家莊 050000)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，前者具有碳酸鹽礦化功能，本研究中將其命名為菌株A1，后者具有磷酸鹽礦化功能，本研究中將其命名為菌株A2，通用下文。

碳酸鹽礦化菌培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化鈉5 g/L，尿素20 g/L，調節(jié)pH值至 7.2～7.4，尿素需配制成尿素溶液后加入培養(yǎng)基中，因尿素高溫易變性，影響試驗結果。

磷酸鹽礦化菌培養(yǎng)基：植酸鈉1 g/L，牛肉膏 3 g/L，氯化鈉5 g/L，蛋白胨5 g/L，調節(jié)pH值至7.0～7.2，于121 ℃下高溫高壓滅菌25 min。

LB固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉 5 g/L，調節(jié)pH值至7.0～7.2，121 ℃下高溫高壓滅菌25 min。

供試土壤：采自河北省淶源縣獨立山城礦開發(fā)園區(qū)(114°29′24.52″E，39°13′42.14″N)，基本理化性質：pH值為 6.23，總氮含量101.2 mg/kg，速效磷含量23.8 mg/kg，速效鉀含量232.5 mg/kg，有機質含量4.36%，總Cu含量 257 mg/kg，有效態(tài)Cu含量84.5 mg/kg。以下土培試驗均用此供試土壤。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 首先將菌株A1、A2的菌體細胞分別劃線于LB固體培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)24 h，然后向長滿菌體細胞的平板中加入無菌水，用燒紅滅菌過的接種環(huán)將菌體細胞刮離固體培養(yǎng)基進入無菌水中，將含有菌體細胞的懸濁液倒入離心管中，在渦旋振蕩器上振蕩均勻后，再用無菌水分別將2種菌株清洗離心，反復3次，最后將菌株A1和A2的菌懸液D600 nm調節(jié)為0.3左右，即為試驗用菌懸液。該菌懸液用于以下的所有接種試驗。

1.2.2 單一或復合發(fā)酵菌液的制備 發(fā)酵菌液A1的制備：將目標菌株A1接種至碳酸鹽礦化菌培養(yǎng)基中，置于28 ℃、160 r/min的恒溫搖床中進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)36 h后，發(fā)酵菌液A1制備完成。

發(fā)酵菌液A2的制備：將目標菌株A2接種至磷酸鹽礦化菌培養(yǎng)基中，置于28 ℃、160 r/min的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)36 h后，發(fā)酵菌液A2制備完成。

復合發(fā)酵菌液的制備：將發(fā)酵菌液A1和A2按一定比例混合，制備成復合發(fā)酵菌液。

1.2.3 單一發(fā)酵菌液和復合發(fā)酵菌液對Cu2+的去除 向 20 mL 質量濃度為40 mg/L的氯化銅溶液中分別加入10、20、40 mL 發(fā)酵菌液A1、發(fā)酵菌液A2和復合發(fā)酵菌液，分別在室溫下沉淀12 h后，過 0.45 μm 濾膜，利用原子吸收分光光度計測定濾液中Cu2+含量，計算去除率。去除率=(去除前Cu2+質量濃度-去除后Cu2+質量濃度)/去除前Cu2+質量濃度×100%。

1.2.4 發(fā)酵菌液的混合比例對重金屬去除的影響 將菌株A1和A2的發(fā)酵菌液分別按1 ∶4、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1和4 ∶1的體積比混合均勻，制備成復合發(fā)酵菌液。將各混合比例的復合發(fā)酵菌液按照與含Cu2+溶液體積比為2 ∶1的比例分別加入到Cu2+溶液中，室溫下沉淀12 h后，過濾，測定上清液中的Cu2+質量濃度，分別計算去除率。

1.2.5 不同初始Cu2+質量濃度對去除效果的影響 經前期大量試驗驗證，得出在復合發(fā)酵菌液 A1 ∶A2 的體積比為2 ∶1時，去除效果最佳。因此，將 20 mL 體積比為2 ∶1的復合發(fā)酵菌液分別加入到10 mL Cu2+質量濃度為10、20、40、60 mg/L的Cu溶液中，混合均勻，室溫下沉淀12 h后，測定上清液中Cu2+質量濃度，計算去除率。

1.2.6 沉淀時間對復合菌液去除Cu2+的影響 將20 mL A1 ∶A2 體積比為2 ∶1的復合發(fā)酵菌液加入到10 mL Cu2+質量濃度為40 mg/L的Cu溶液中，混合均勻，在室溫下分別沉淀0、6、12、18、24、30、36 h 后(分別做3組平行試驗，共15個小三角瓶)，測定上清液中Cu2+質量濃度，并計算去除率。

1.2.7 溫度對復合發(fā)酵菌液去除Cu2+效果的影響 將 20 mL A1 ∶A2體積比為2 ∶1的復合發(fā)酵菌液加入到10 mL Cu2+質量濃度為40 mg/L的Cu溶液中，混合均勻后分別在4、21(室溫)、50 ℃下沉淀 24 h 后，測定上清液中Cu2+質量濃度，計算去除率。

1.2.8 單一和復合發(fā)酵菌液對土壤中有效態(tài)重金屬的固定 稱取100 g土壤平整鋪入小花盆中，按照土液比2 g ∶1 mL的比例分別加入50 mL發(fā)酵菌液A1、50 mL發(fā)酵菌液A2及50 mL復合發(fā)酵菌液，并攪拌均勻，期間按照正常的水肥管理方法進行管理。分別在培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d后取樣，測定土壤中有效態(tài)Cu含量，比較單一或復合發(fā)酵菌液對土壤中有效態(tài)Cu的固定效果。

1.2.9 測定方法 土壤中有效態(tài)Cu的測定：利用DTPA法浸提出土壤中有效態(tài)的Cu，用0.45 μm針式過濾器過濾后，用空氣乙炔原子吸收分光光度計測定[14]。

溶液中Cu2+的測定：將溶液過0.45 μm針式過濾器，然后用原子吸收分光光度計測定Cu2+質量濃度。

1.3 數據處理與分析

所有試驗重復3次，試驗數據利用Excel 2010進行處理，用“平均值±標準差”表示，用DPS 7.05軟件進行誤差分析。

2 結果與分析

2.1 單一和復合發(fā)酵菌液對Cu2+的去除

從圖1中可以看出，無論加入量多少，復合發(fā)酵菌液對Cu2+的去除率均高于單一發(fā)酵菌液的去除率，且加入量為40 mL(菌液與重金屬溶液體積比為2 ∶1)時，去除效率最高，可達到96.4%。

2.2 發(fā)酵菌液的混合比例對Cu2+去除的影響

從圖2中可以看出，發(fā)酵菌液隨著A1占比增大，對Cu2+的去除率逐漸增加，當發(fā)酵菌液A1 ∶A2體積比為2 ∶1時，溶液中Cu2+的去除率可達到最大，為98%，A1占比繼續(xù)增大時，去除率反而會呈現(xiàn)降低趨勢。

2.3 不同初始Cu2+質量濃度對去除效果的影響

從圖3中可以看出，隨著Cu2+初始質量濃度的增加，復合發(fā)酵菌液對其去除率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當初始質量濃度為40 mg/L時，去除率達到最大，為96.8%。但當初始質量濃度更大時，發(fā)酵菌液對溶液中Cu2+的去除率則出現(xiàn)下降趨勢。

2.4 沉淀時間對去除Cu2+的影響

由圖4中可以看出，復合發(fā)酵菌液對Cu2+的去除率隨著沉淀時間的延長而不斷增大，到24 h時達到最大，最大去除率可達到98%以上，隨后去除率趨于穩(wěn)定。

2.5 溫度對復合發(fā)酵菌液去除Cu2+效果的影響

從圖5中可以看出，高溫下的去除率高于低溫時，且增幅為17.7%，室溫下的去除率和高溫時相差無幾，說明只有低溫會抑制復合發(fā)酵菌液對Cu2+的去除作用。

2.6 單一和復合發(fā)酵菌液對土壤中有效態(tài)重金屬的固定

從圖6中可以看出，復合發(fā)酵菌液對土壤中有效態(tài)Cu的固定效果高于單一發(fā)酵菌液，在培養(yǎng)3～9 d快速固定有效態(tài)Cu，且在15 d內，復合發(fā)酵菌液對有效態(tài)Cu的固定率可達到80.26%，分別高出單一A1、A2發(fā)酵菌液固定率13.04%、17.45%。

3 討論與結論

自然界中的很多微生物都具有固定重金屬的能力，但能夠固定后使其穩(wěn)定不釋放的方法不多見，而當前大多數學者都把目光集中在了如何使土壤或者水體中的重金屬失去毒性，保持其原有的微量元素的可利用性。但暫時的使重金屬失去毒性很容易，要長期穩(wěn)定地保持這種效果就比較難處理。一些專家學者利用微生物的吸附、吸收或者胞吞作用去除重金屬的危害，這樣的方式效果很明顯，但一段時間后，隨著細胞的死亡，重金屬被重新釋放，再次污染水體或者土壤。隨著研究的不斷深入，已經有一些研究發(fā)現(xiàn)了能夠有效固定重金屬，且能保持一段時間內不會因為自然環(huán)境的改變或者細胞的死亡而重新造成毒害作用的方法——生物礦化法[15]。目前已有一些關于生物礦化作用的研究成果，如錢春香等研究了一株枯草芽孢桿菌的碳酸鹽礦化作用對Cu2+的去除機制，結果表明，在堿性條件下更利于生物礦化作用的產生且產生的礦化產物更加穩(wěn)定[12]。之后，錢春香團隊的王明明等利用國外進購的具有磷酸鹽礦化作用的菌株，對Zn2+的生物礦化作用機制進行研究，結果也表明了堿性條件是產生生物礦化作用的重要因素，在堿性環(huán)境下能夠生成較穩(wěn)定的產物[11]。但目前的研究仍停留在單一碳酸鹽礦化作用或磷酸鹽礦化作用，復合的礦化效果是否會更好還沒有被具體報道。因此，本文利用能夠碳酸鹽礦化的巨大芽孢桿菌和能夠磷酸鹽礦化的枯草芽孢桿菌進行了復合礦化效果研究，結果表明復合發(fā)酵菌液的效果確實會高于單一發(fā)酵菌液，且在菌液A1 ∶A2體積比為2 ∶1時礦化效果最好。隨后又研究了初始Cu2+質量濃度、沉淀時間和溫度對礦化效果的影響，從而發(fā)現(xiàn)初始質量濃度越大，礦化效果越好，但在Cu2+質量濃度超過40 mg/L時，礦化效果會受到抑制作用；礦化效果也會隨著時間的延長越來越好，當沉淀時間超過24 h后逐漸趨于穩(wěn)定，無明顯變化；在溫度越高時，礦化效果越好。最后，研究了單一和復合發(fā)酵菌液對土壤中有效態(tài)Cu的固定效果，通過土培試驗得知，復合發(fā)酵菌液對土壤中有效態(tài)Cu的固定效果高于單一發(fā)酵菌液，且在15 d內，復合發(fā)酵菌液對有效態(tài)Cu的固定率可達到 80.26%。以上所有研究表明，復合發(fā)酵菌液的生物礦化作用高于單一發(fā)酵菌液，但復合發(fā)酵菌液中的單一因素如何共同對重金屬離子產生生物礦化作用還在進一步研究。

綜上所述，本研究可得出以下結論：復合發(fā)酵菌液對Cu2+的礦化效果高于單一的，且在發(fā)酵菌液A1 ∶A2體積比為2 ∶1時礦化效果最好。分別在Cu2+初始質量濃度為40 mg/L、沉淀時間為24 h和高溫時，復合發(fā)酵菌液對Cu2+的礦化效果最好，Cu2+的最大去除率可分別達到96.8%、98.4%和98.1%。土培試驗表明，復合發(fā)酵菌液對土壤中有效態(tài)Cu的固定作用高于單一發(fā)酵菌液的作用，且15 d內固定率可達到80.26%。