外源褪黑素對低溫脅迫下煙草幼苗生理指標的影響

張嘉雯， 盧紹浩， 趙喆， 趙銘欽

(河南農業大學煙草學院，鄭州 450002)

煙草是一種經濟作物，原產于熱帶和亞熱帶，作為一種喜溫作物，其對溫度的變化比較敏感[1]。煙草植株在10～35 ℃范圍內都能生長，最適溫度為25～28 ℃，當溫度降到12 ℃以下時，光合速率受阻，出苗率受到影響，苗期生長緩慢[2]。低溫脅迫下，煙草幼苗除生長受到抑制，生理代謝發生紊亂，植株受到氧化傷害，抗逆性減弱[3]。對南方很多煙區而言，在早春季節常有“倒春寒”等低溫危害發生，不利于壯苗的培育，導致移栽后苗質差，緩苗期延長，煙葉的產量和質量受到影響[2]。如何緩解低溫脅迫對煙草植株的傷害一直是人們急待解決的問題。

褪黑素(melatonin，MT)又稱松果體素，是一種生命必需的吲哚胺類物質，存在于許多物種之中[4]。近年來，國內外學者在植物褪黑素方面的研究取得較多成果，盡管植物體內的褪黑素含量很少，卻在增加植物抗逆性以及生理調節方面有著重要作用[5-6]。褪黑素被認為是一種新的植物生長調節劑和生物刺激劑，具有很強的抗自由基作用，能減少動植物體內過氧化氫和超氧陰離子的含量，增加抗氧化酶基因的表達；還能緩解多種脅迫對高等植物的損傷，增強植物的抗逆性[7-8]。李猛等[9]研究表明，外源褪黑素可以顯著增強鹽脅迫下煙草幼苗的光合能力和抗氧化能力。王英利等[10]發現，褪黑素處理能緩解綠豆幼苗UV-B輻射引起的氧化脅迫。Li等[11]報道，外源褪黑素能有效增強植物對高鹽環境的適應能力，提高植物的光合效率，降低高鹽環境對植物的氧化性損傷。煙草對溫度變化較為敏感，在實際生產中，苗期常受到低溫的影響而使移栽后的幼苗抗性較弱。目前，褪黑素對低溫脅迫下一些農作物的研究較廣，而對低溫脅迫下煙草幼苗生理特性的影響研究，還未見報道。本研究以煙草幼苗為材料，針對煙草苗期易受冷害現狀，通過施加不同濃度的外源褪黑素，研究低溫脅迫下煙草的生理特性變化，進一步探究外源褪黑素在植物抗冷方面的作用，旨在為煙草栽培與管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年10月在河南農業大學煙草學院RXZ智能型人工氣候箱(寧波江南儀器廠)中進行。供試品種為云煙87。培養條件為：光周期14 h晝/10 h夜、晝夜溫度(25±1)/(18±1)℃、相對濕度50%。

1.2 試驗設計

將煙草種子用2%的H2O2溶液消毒10 min，蒸餾水沖洗后浸種24 h，點種至育苗盤。待煙葉長至3葉1心時，選取形態大小基本一致的幼苗移入裝有1/3 Hoagland營養液的黑色塑料盆中，每盆4株，每3 d換一次營養液，營養液濃度隨煙葉長勢增大而增加，當煙葉幼苗生長至4片葉時，澆施1/2 Hoagland營養液，長至5片葉時，澆施全營養液。

通過前期預試驗，確定并篩選出效果比較明顯的褪黑素濃度。當煙葉長至5葉時選取形態長勢基本一致的幼苗移至裝有Hoagland營養液的水培盒中，分別加入濃度為0(CK)、50(T1)、100(T2)、150(T3)、200(T4)μmol·L-1的外源褪黑素(索萊寶生物有限公司)。處理3 d后將幼苗置于溫度為(8±1)℃、濕度為50%的人工氣候箱中進行低溫脅迫處理，在0、24、48、72 h時，采集第3、4片煙葉，用于各生理指標測定，3次重復。

1.3 測定項目與方法

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據統計及作圖，利用SPSS 21.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下外源褪黑素對煙草幼苗葉片產生速率和H2O2含量的影響

注：同一時間不同小寫字母表示處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。

2.2 低溫脅迫下外源褪黑素對煙草幼苗葉片脯氨酸含量和MDA含量的影響

由圖2可知，煙草幼苗MDA含量隨脅迫時間的延長而總體呈逐漸上升趨勢。在5個處理中，MDA含量隨褪黑素濃度的增加而呈先降低后升高趨勢，脅迫處理0 h時，5個MT處理間的MDA含量無顯著差異；脅迫處理24、48 h時，T2、T3處理的MDA含量最低，二者間無顯著差異；脅迫處理72 h時，T2、T3、T4處理間無顯著差異，T2處理顯著低于CK和T1處理。煙草幼苗葉片中脯氨酸含量低溫脅迫后顯著高于脅迫前，呈單峰變化趨勢，在24、48 h時脯氨酸含量較高。褪黑素處理的煙草幼苗中脯氨酸含量均顯著升高。在脅迫處理0、48 h時，T1、T2處理的脯氨酸含量最高，二者間沒有顯著性差異；脅迫處理24、72 h時，T2、T3處理的脯氨酸含量最高，二者間沒有顯著性差異。脅迫24、48和72 h時，T2處理的脯氨酸含量分別比CK顯著升高了41.17%、30.17%和35.95%。結果表明，經褪黑素處理的煙草幼苗膜脂過氧化產物MDA含量減少，而脯氨酸大量積累，因而減輕了低溫脅迫對細胞膜的損傷，提高了植物的抗逆性。

注：同一時間不同小寫字母表示處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。

2.3 低溫脅迫下外源褪黑素對煙草幼苗葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

可溶性蛋白和可溶性糖作為植物體內重要的滲透調節物質，對提高植物抗性具有重要作用。從圖3可以看出，隨著低溫脅迫處理時間的延長，煙草幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量整體呈先增加后減小的趨勢。可溶性蛋白含量在脅迫處理0、24 h時T2處理最高；脅迫處理48、72 h時T2、T3、T4處理較高，三者間無顯著差異；脅迫處理0、24、48、72 h時，T2處理的可溶性蛋白含量分別比CK顯著增加47.82%、31.39%、36.12%和58.68%。可溶性糖含量在脅迫處理48 h時達到峰值；脅迫處理24、48 h時，T2處理最高，顯著高于其他處理；脅迫處理72 h時，T2、T3處理較高，二者之間沒有顯著性差異。低溫脅迫0、24、48、72 h時，T2處理的可溶性糖含量分別比CK顯著增加了25.49%、57.36%、34.79%和35.20%。結果說明，適宜濃度的褪黑素處理可以增加煙草幼苗葉片的可溶性蛋白和可溶性糖含量，提高煙草幼苗的滲透調節物質水平，增強抗逆性。

注：同一時間不同小寫字母表示處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。

2.4 低溫脅迫下外源褪黑素對煙草幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

SOD、POD和CAT是植物體內3種主要的抗氧化酶，它們在活性氧自由基的清除過程中發揮著重要作用。由圖4可知，在低溫脅迫下，SOD和CAT活性隨著脅迫時間的延長呈先降低后升高再降低趨勢，呈倒“N”型變化趨勢；而POD活性隨著脅迫時間的延長呈下降趨勢。在脅迫處理 0 h 時，SOD、POD和CAT活性在5個處理間均沒有顯著差異。不同低溫脅迫處理時間的煙草幼苗葉片SOD、POD和CAT活性均隨褪黑素濃度的增加而呈先升高后下降趨勢。在脅迫處理24、48 h時，T2、T3處理的SOD活性最高，二者間沒有顯著差異；72 h時，T2處理的SOD活性最高。在脅迫處理24、72 h時，T2、T3處理的POD活性最高，二者間沒有顯著差異；48 h時，T2處理的POD活性最高。在脅迫處理24 h時，T2、T3處理的CAT活性最高，二者間沒有顯著差異；48、72 h時，T2處理的CAT活性最高。在低溫脅迫48 h時，T2處理使SOD和CAT活性分別比對照顯著增加了46.82%和27.88%。可見，外源褪黑素對低溫脅迫下煙草幼苗葉片抗氧化酶活性均有顯著的促進效應，總體100 μmol·L-1褪黑素處理效果最好。

注：同一時間不同小寫字母表示處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。

3 討論

脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖是植物體內重要的滲透調節物質，在提高植物抗性方面發揮著重要作用[20]。在逆境條件下，脯氨酸含量大量積累，積累的脯氨酸除了維持體內滲透平衡外，還具有穩定生物大分子結構、清除活性氧以及促進幼苗生長的作用[21]。陳璇等[22]研究了新疆冬小麥和春小麥幼苗在低溫條件下脯氨酸的積累情況，表明脯氨酸含量在低溫脅迫時明顯提高。本研究表明，低溫脅迫下，煙草幼苗脯氨酸含量迅速增加，48 h后逐漸下降；外源褪黑素處理的煙草幼苗脯氨酸含量均明顯提高。這可能由于低溫脅迫后，植物體內生理生化特性發生變化，外源褪黑素能促進煙草幼苗合成更多的脯氨酸，滲透調節物質的積累可維持植物體內的代謝平衡[23]。可溶性蛋白含量常用作篩選抗性的指標之一，是植物體內重要的營養物質和滲透調節物質，能保護細胞的生命物質及生物膜，增強細胞的保水能力[24]。可溶性糖在植物體內不僅具有信號功能，而且為植物的生長發育提供能量和代謝中間產物，對植物的生命周期發揮著重要作用[25]。一般在逆境脅迫下植物體內可溶性蛋白和可溶性糖含量會發生累積。吳雪霞等[18]報道，茄子幼苗在低溫脅迫下可溶性蛋白含量比對照顯著增加，外施褪黑素提高了茄子幼苗葉片中滲透調節物質的含量。趙小紅等[26]研究表明，低溫脅迫下，黃瓜幼苗中可溶性糖含量先升高后降低，噴施100 μmol·L-1褪黑素能有效提高可溶性糖含量。本研究發現，在低溫脅迫下，煙草幼苗葉片中可溶性蛋白和可溶性糖含量呈單峰變化趨勢。這可能是低溫導致植物合成更多的可溶性蛋白和可溶性糖，束縛細胞中更多的水分，增強細胞的持水力，減少原生質因結冰而傷害致死的機會[27]，而長時間低溫導致蛋白質活性降低，光合作用的關鍵酶失活，使葉片中光合產物糖的含量降低[28]。施加褪黑素能顯著提高煙草幼苗葉片中的可溶性蛋白和可溶性糖含量，說明褪黑素處理能增強植物抵御低溫的能力，提高植物的抗逆性，但高濃度的褪黑素則有抑制作用，這也與吳雪霞等[18]、趙小紅等[26]研究結果相一致。

SOD、CAT和POD是植物酶促防御系統的重要保護酶，它們對活性氧自由基的清除發揮著重要的作用，從而減輕逆境脅迫對植物的傷害[29]。本研究表明，SOD和CAT活性隨著脅迫時間的延長先降低后升高，48 h后再緩慢下降，而POD活性一直呈下降趨勢，這可能是由于植物在低溫脅迫后，活性氧大量積累，消耗了更多的抗氧化酶，使酶活性降低；之后植株產生了一定的抗寒性，酶活性有所升高，長時間的低溫又破壞了酶的活性，使酶活性又逐漸下降[30]。這與趙小紅等[26]在黃瓜上的研究結果不同，其SOD、CAT活性隨脅迫時間的增加呈先上升后下降趨勢，這可能由于低溫脅迫下不同植物的抵御方式不同。本研究中用外源褪黑素處理的煙草幼苗葉片SOD、POD和CAT活性均顯著增加，褪黑素濃度過低促進作用較弱，濃度過高抑制植物生長。說明適宜的外源褪黑素能提高低溫脅迫下幼苗抗氧化酶活性，增強幼苗對活性氧的清除能力，提高幼苗耐低溫的能力。