土木香內酯抑制宮頸癌細胞的增殖及其機制研究

謝麗霞 許倩倩 徐紅霞 杜凱麗 桑明，2，3 孫曉東，2，3

湖北醫藥學院1附屬襄陽市第一人民醫院中心實驗室，2武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，3胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室（湖北襄陽441000）

宮頸癌是威脅女性健康最常見的第二大惡性腫瘤，且發病年齡逐漸年輕化。中國每年新發病例達13.15萬，死亡人數每年約5.3萬，約占全部女性惡性腫瘤死亡人數的18.4%［1］。患者接受放、化療后，都伴隨有嚴重的不良反應和并發癥［2］。故尋找高效、毒副作用小且廉價的治療藥物和方法迫在眉睫。中藥單體的抗腫瘤效果引起了全世界的關注，其中，土木香內酯（Alantolactone，AL）是提取自土木香等中草藥植物的一種倍半萜烯內酯類化合物，廣泛存在于菊科屬植物中，土木香內酯具有多種生物活性，在抗腫瘤方面的作用日益受到關注［3-9］。BMI1原癌基因（BMI1 proto-oncogene，polycomb ring finger，BMI1）編碼一種環指蛋白，該蛋白是多梳家族（polycomb group complex 1，PRC1）的主要成分，主要通過染色質重構在胚胎發育和干細胞自我更新過程中起重要作用［10］，該基因是一種致癌基因，異常表達與許多癌癥有關，并與化療藥物的耐藥性有關。有報道BMI1在多種腫瘤中均有呈高表達［11-17］，其高表達與腫瘤進展相關，預示腫瘤具有高度轉移潛能［13，15，17-18］。AL 是否通過抑制BMI1的表達阻滯宮頸癌細胞的增殖，尚不明確，本文旨在通過施予AL后檢測宮頸癌Hela細胞中BMI1的表達水平，探討其抗癌機制，為宮頸癌的臨床治療提供新途徑奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 Hela細胞購自中國科學研究院上海細胞生物研究所。土木香內酯標準品（D0221）購自上海寶曼生物科技有限公司；細胞培養及研究所用的高糖DMEM、胰酶、胎牛血清購自Gibco公司（美國）；Trizol購自Invitrogen；逆轉錄酶、RNA酶抑制劑購自Promega公司（美國），SYBR Green PCR Mix購自Bio-Rad公司（美國）；兔抗BMI1多克隆抗體、小鼠抗GAPDH多克隆抗體購自Cell Signaling Technology（美國）；HRP標記的山羊抗兔和馬抗小鼠的二抗購自Abbkine公司（美國）。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。實驗所用引物由金凱瑞生物工程有限公司合成（武漢），BMI1過表達質粒由湖南豐匯生物科技公司設計合成（長沙），shRNA干擾質粒、轉染試劑MATE Plus由上海吉瑪制藥技術有限公司設計、合成。

1.1.2 儀器與設備 SpectraMax i3X多功能酶標儀購自Molecular Devices公司（美國），Ⅸ70倒置顯微鏡購自Olympus公司（日本），ABI 7500-PCR儀購自Life technology公司（美國），垂直電泳設備、蛋白轉印設備、蛋白/核酸凝膠成像儀均BioRad公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥液稀釋 Hela細胞用含10%FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養基培養，置于5%CO2，37℃恒溫培養箱中培養至對數生長期，用于后續實驗。無水乙醇溶解土木香內酯（AL），使儲存濃度為100 mmol/L，-20℃避光保存備用。使用時采用DMEM高糖完全培養基稀釋至實驗所需濃度。

1.2.2 CCK-8檢測細胞活性 取對數生長期細胞，消化計數后接種于96孔板中，每孔5 000個細胞，每組設4個復孔，37℃培養24 h，棄去培養基，向孔板中加入含不同濃度 AL（0、2.5、5.0、10、20、40、80 μmol/L）的新鮮培養基，37℃恒溫孵育24 h后，在各孔中加入10 μL CCK-8試劑，37℃恒溫搖床孵育2～4 h終止，采用酶標儀測定在450 nm處的OD值。計算細胞活性以及AL的IC50值。

1.2.3 平板克隆形成實驗 將對數生長期的細胞消化計數后接種至6孔細胞培養板每孔分別接種100個細胞，置37℃，5%CO2培養箱中培養24 h，分別更換 2 mL 含不同濃度 AL（0、1.25、2.5、5.0 μmol/L）的培養基連續培養2～3周，每周換液一次；顯微鏡下觀察對照組有明顯的50個細胞以上的克隆形成時，棄去上清液，PBS洗2次，加4%多聚甲醛固定15 min，去固定液，加0.1%結晶紫染色液染20 min，洗去染色液，干燥后拍照，計算克隆形成率。

1.2.4 q-PCR檢測BMI1基因表達 收集經0、1.25、2.5、5.0 μmol/L AL處理24 h后的細胞，抽提總RNA，用m-MLV逆轉錄酶和Oligo（dt）20逆轉錄合成cDNA，按SYBR Green試劑說明進行，PCR體系為20 μL，反應條件：95 ℃ 變性15 s，58 ℃ 退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環。每個樣品設3個復孔，Ct取其平均值，以GAPDH作為內參。引物序列如下：GAPDH，F：5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3′，R：5′-CAAGGGGTCTACATGGCAAC-3′；BMI1，F：5′-AGTGACTCTGGGAGTGACAAGG-3′，R：5′-ATTGGTGGTTACCGCTGG-3′。

1.2.5 Western blot檢測 收集經過AL處理的細胞，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，每組以30 μg總蛋白量進行上樣，經凝膠電泳分離，采用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育過夜后洗膜，再孵育二抗2 h，洗膜顯影。

1.2.6 過表達和敲低BMI1基因 取對數期的細胞，調整細胞濃度為5×104/mL，接種2 mL/孔于6孔板中，接種100 μL/孔于96孔板，分別設空載對照組、過表達組/敲低組、過表達+AL/敲低+AL組，待細胞匯合度達到60%～70%時，進行質粒轉染，37℃5%CO2培養箱中培養24 h，再加入終濃度5.0 μmol/L的AL繼續培養24 h。BMI1重組質粒由湖南豐匯生物技術有限公司合成，shRNA干擾序列由上海吉瑪公司設計合成。

1.3 統計學方法 應用Graph pad 7.0軟件對各實驗的結果數據進行分析，計量資料以表示，兩組間數據用t檢驗，多組間數據用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AL抑制Hela細胞的活性 Hela細胞經不同濃度的AL處理后，CCK-8法檢測結果顯示，AL能顯著抑制Hela細胞的增殖，濃度5.0 μmol/L的AL即可顯著抑制Hela細胞活性（P＜0.01），且AL對Hela細胞活性的抑制呈劑量依賴性（圖1A）；計算AL在24 h對Hela細胞的IC50為21.66 μmol/L（圖1B）。

2.2 AL抑制Hela細胞的克隆形成能力 平板克隆形成實驗結果顯示，隨著藥物濃度的增加Hela細胞的克隆能力顯著下降且呈劑量依賴性（圖2A），統計各組克隆數目，比較結果顯示1.25 μmol/L的AL即可顯著抑制Hela細胞克隆形成（P＜0.01），隨AL濃度增加克隆形成率逐漸下降（圖2B）。顯微鏡下觀察克隆及細胞形態，發現對照組克隆較大，細胞間連接緊密，保持Hale細胞的典型形態；AL作用后，克隆較小，細胞間空隙增加；隨濃度增高細胞形態發生變化，細胞核增大、細胞膜向外形成突觸樣結構。見圖2C。

圖1 AL抑制Hela細胞的活性Fig.1 AL inhibited the activity of Hela cells

圖2 AL抑制Hela細胞克隆形成Fig.2 AL inhibited the colony formation of Hela cells

2.3 AL抑制BMI1的表達 q-PCR檢測結果顯示，不同濃度AL處理Hela后，BMI1的表達受到顯著抑制，隨著AL濃度的增加，BMI1的mRNA表達明顯降低（P＜ 0.05）；見圖3A，Western blot檢測結果表明AL能在蛋白水平抑制BMI1的表達（P＜0.01，圖3B）。BMI1過表達質粒轉染Hela細胞24 h后，PCR檢測和Western blot檢測均顯示BMI1表達水平升高（P＜0.01），再加入AL處理24 h，BMI1表達在mRNA水平和蛋白水平均被AL抑制（P＜0.05），見圖3C、D。

圖3 AL抑制BMI1的表達Fig.3 AL inhibited the expression of BMI1

2.4 AL抑制BMI1過表達引起的Hela細胞增殖提高shBMI1抑制效率 過表達BMI1后檢測Hela細胞的活力，結果顯示隨著過表達時間的延長細胞增殖的活力越強（P＜0.001），從而表明BMI1對Hela細胞的增殖有顯著的調控作用；過表達BMI1 24 h后，加入 5.0 μmol/L 的 AL，細胞活性受到抑制，且隨AL作用時間延長抑制越明顯（P＜0.01），結果如見4A。shBMI1質粒轉染Hela細胞24 h后，PCR檢測，篩選出敲低效率最高的shRNA質粒，見圖4B，shBMI1-588敲低效率最高，后續實驗均選用該質粒進行。PCR檢測和Western blot檢測均顯示shBMI1-588質粒轉染Hela 24 h后，BMI1基因的mRNA和蛋白表達水平均被下調（P＜0.01），再加入AL處理24 h，BMI1表達在mRNA水平和蛋白水平均被AL進一步抑制（P＜0.05），見圖4C和4D。

3 討論

中藥單體用于抗腫瘤治療的研究也越來越廣泛［19］，近年來發現了許多天然藥物單體化合物具有良好的抗腫瘤活性，AL是常見的倍半萜內酯類化合物，具有不飽和的五元內酯環結構，已有文獻報道其抗腫瘤機制主要包括誘導細胞外源性及內源性凋亡，AL誘導線粒體膜電位改變介導凋亡［5，20］或誘導ROS的積累介導凋亡［7，21］，調節凋亡相關蛋白表達從而介導凋亡［22］，或者抑制細胞周期素依賴性激酶而降低周期素的表達使細胞周期停滯而抑制增殖［9，22］，AL 還可抑制腫瘤血管生成抑制腫瘤生長［23］。本研究選擇宮頸癌Hela細胞作為研究對象，觀察AL對Hela細胞活性及增殖能力的抑制效應，探討AL對原癌基因BMI1的表達有什么影響以及AL通過抑制BMI1的表達對Hela細胞活性產生抑制效應的機制。

圖4 AL抑制BMI1過表達引起的Hela細胞增殖提高shBMI1抑制效率Fig.4 AL inhibited the proliferation of Hela cells and promoted the inhibition efficiency of shBMI1 in Hela cells

首先給予不同濃度的AL處理，CCK8檢測細胞活性降低，且抑制細胞克隆形成，表明AL對宮頸癌Hela細胞具有抑制作用，且呈明顯的濃度依賴性。BMI1通過組蛋白H2A lysine119泛素化作用（UbH2A K119）下調E3連接酶和RNF144A的表達，啟動細胞的無限增殖［24-25］，在宮頸癌組織中，BMI1基因的高表達與更高的臨床分期、腫瘤高浸潤性、高轉移性及宮頸癌細胞干性相關，異常升高的BMI1通過增強Sox2基因的轉錄調控，促進宮頸癌的致瘤性和腫瘤球的形成［26］。干擾BMI1能顯著抑制AKT的活性，上調Bax的表達并下調Bcl-2的表達，從而促進腫瘤細胞凋亡［27］。由此可見，BMI1基因是維持宮頸癌進展的重要原癌基因。筆者選擇小于IC50的藥物濃度處理Hela細胞，Realtime PCR和Western blotting檢測BMI1基因的表達，結果顯示隨著藥物濃度的增加，BMI1在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低。推測AL可能通過抑制Hela細胞中BMI1的表達從而抑制細胞增殖。為了進一步驗證這一可能機制，本研究將Hela細胞中的BMI1基因進行過表達，發現BMI1基因過表達明顯促進Hela細胞的增殖，過表達BMI1基因后再給予AL作用，可以抑制細胞的增殖；通過Real-time PCR和Western blotting檢測BMI1基因的表達，結果證實AL可以抑制BMI1的過表達，同時，在shRNA質粒敲低BMI1基因的表達后，AL可以進一步抑制BMI1的表達水平。可見，BMI1基因對Hela細胞維持增殖能力至關重要，AL通過抑制BMI1基因的表達阻滯Hela細胞的增殖，而BMI1基因對抑癌基因p16INK4a的抑制會促進細胞周期的不斷更新［28］，AL可能是通過抑制BMI1的表達恢復p16INK4a對細胞周期的抑制作用而發揮抑癌效應。

綜上所述，土木香內酯在體外能夠抑制宮頸癌Hela細胞的增殖，高表達的BMI1是Hela細胞維持增殖活性的關鍵，土木香內酯抑制Hela細胞的活性可能是通過調控BMI1的表達來進行的。本研究為土木香內酯治療宮頸癌提供了實驗依據，也為土木香內酯的藥物開發奠定了研究基礎。