LncRNA FZD10-AS1通過調控miR-337-3p/GPD1分子軸抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移

李帥 董震 王曉晨 丁濤

1青島大學附屬青島婦女兒童醫院兒童骨科（山東青島266000）；勝利油田中心醫院2藥學部，3脊柱外科（山東東營257000）

骨肉瘤是一種最常見的骨原發惡性腫瘤，好發于青年患者［1］。雖然骨肉瘤治療已取得一定進展，但由于骨肉瘤惡性程度高且進展快，早期即易轉移，復發率高，因此骨肉瘤患者的總體預后較差［2-3］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與細胞多種生命活動如分化、增殖、凋亡、衰老、遷移等行為密切相關［4］。越來越多研究［5-6］表明，lncRNA在多種類型的腫瘤中異常表達，通過多種分子機制參與腫瘤的進展和轉移。近年來，lncRNA在骨肉瘤發生、發展中的作用逐漸引起關注［7］。FZD10-AS1是一種新發現的lncRNA，其在骨肉瘤中的表達情況及作用機制尚不清楚。本研究檢測FZD10-AS1對骨肉瘤細胞增殖、遷移能力的影響，并研究骨肉瘤細胞中FZD10-AS1對下游靶基因表達的調控作用，為骨肉瘤的分子靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集 收集青島大學附屬青島婦女兒童醫院兒童骨科2016年9月至2018年12月行骨肉瘤根治術切除47例骨肉瘤患者的癌組織及相應癌旁組織，術后立即于液氮中保存。男性和女性患者分別為28例和19例，平均（18.75±8.49）歲。所有患者術前未接受放療、化療、生物治療等。所有組織均經病理切片證實。本研究經本院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞與主要試劑 正常成骨細胞hFOB1.19和骨肉瘤細胞MG-63、Saos2、143B、HOS 和U-2OS購自美國標準培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。qRT-PCR相關試劑盒購于日本TaKaRa公司。RPMI 1640培養基、DMEM/F12培養基、胎牛血清購自美國Amresco公司。CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。表達FZD10-AS1的質粒、陰性對照質粒和PCR引物（GAPDH、GPD1、FZD10-AS1、miR-337-3p、U6）購自上海吉瑪生物制藥有限公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。一抗 GPD1、β-Tubulin、E-cadherin、ZEB-2、CDK7、Cyclin H及二抗均購自美國CST公司。

1.3 細胞培養及質粒轉染 143B和HOS細胞培養于添加含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中，Saos2、MG-63和U-2OS細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養液中，于37℃、體積分數5%CO2孵箱中培養。hFOB1.19細胞培養在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養液中，于34°C、5%CO2孵箱中培養。轉染前1 d將U-2OS細胞種于6孔板，使用表達FZD10-AS1的質粒或陰性對照質粒分別與Lipofectamine 2000脂質體混合轉染U-2OS細胞，操作按照Lipofectamine 2000說明書進行，48 h后進行后續實驗檢測。

1.4 RNA提取和qRT-PCR 參照TRIzol試劑盒說明書提取骨肉瘤組織和細胞株中總RNA，逆轉錄后獲得cDNA，參照qRT-PCR試劑盒說明書采用相對定量法對組織和細胞中FZD10-AS1、miR-337-3p和GPD1表達量進行檢測，miR-337-3p采用U6作為內參，FZD10-AS1和GPD1采用GAPDH作為內參，qRT-PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性50 s，60℃退火25 s，72℃延伸15 s，設置40 次循環。采用 2-ΔΔCt方法計算 FZD10-AS1、miR-337-3p和GPD1 mRNA的表達量。FZD10-AS1上游引物為 5′-CAAGCCCTACAATTTTTACATCG-3′，下游 引 物 為 5′-CCTGCTTCACCTCCTTCTCATA-3′；GPD1上游引物為 5′-GCCATCTGAAGGCAAACGC-3′，下游引物為5′-GCCAATGGTTGTCTCACAGAAC-3′。U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游引物 為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。GAPDH上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；miR-337-3p上游引物為 5′-GGGCTCCTATATGATGCCT-3′，下游引物為 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

1.5 CCK-8檢測U-2OS細胞增殖能力 對照組和觀察組處于對數生長期的U-2OS細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞，在37℃、5%CO2培養箱中連續培養5 d。在每天相同的時間點，每孔分別加入10 μL的CCK-8溶液，培養箱中培養4 h，酶標儀檢測在450 nm波長下的每孔吸光度（OD）值，繪制U-2OS細胞生長曲線。實驗重復3次。

1.6 細胞劃痕實驗檢測U-2OS細胞遷移能力 對照組和觀察組處于對數生長期的U-2OS細胞接種于6孔板，每孔3×105個細胞，培養至細胞匯合。采用無菌200 μL移液管尖端在每個孔底進行劃痕。采用無菌PBS溶液洗滌3次，充分清除細胞碎片，加入不含血清的培養基培養。24 h后，拍攝記錄每孔細胞的遷移狀態，并計算遷移率。實驗重復4次。

1.7 生物信息學預測FZD10-AS1的下游miRNA及基因 采用LncBase Predicted v.2軟件預測FZD10-AS1可互補結合的miRNA，采用PITA和starBase V2.0軟件預測miRNA的靶基因。

1.8 Western Blot實驗檢測GPD1蛋白的表達量采用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用半干轉移法將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入按一定比例稀釋的一抗 GPD1（1∶1 000稀釋）、β-Tubulin（1∶1 000稀釋）、E-cadherin（1∶500 稀釋）、ZEB-2（1∶500）、CDK7（1∶2 000）及Cyclin H（1∶2 000），4 ℃過夜孵育，TBST溶液清洗3次后，加入相應二抗在室溫孵育2 h。TBST溶液清洗3次后，加入ECL化學發光液，迅速置于凝膠成像系統中采集圖像并觀察分析。

1.9 統計學方法 所有數據均使用SPSS 21.0軟件分析，計量數據采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FZD10-AS1在骨肉瘤組織和細胞株中表達下調 qRT-PCR檢測結果顯示，骨肉瘤組織FZD10-AS1表達量明顯低于癌旁組織［（1.21±0.45）vs.（5.58± 0.88），P＜ 0.01，圖1］，FZD10-AS1在骨肉瘤細胞株中的表達量明顯低于正常成骨細胞（P＜0.01，圖2），其中在U-2OS細胞中表達量最低。

2.2 轉染FZD10-AS1質粒提高U-2OS細胞中FZD10-AS1表達的量 轉染FZD10-AS1質粒后，觀察組U-2OS細胞中FZD10-AS1表達的量明顯高于對照組［（1.00 ± 0.04）vs.（10.55 ± 0.87），P＜ 0.01］。

2.3 過表達FZD10-AS1抑制U-2OS細胞的增殖能力 CCK-8法結果（圖3）顯示，在第3、4、5天，過表達FZD10-AS1的觀察組U-2OS細胞D值明顯低于對照組（P＜0.05），表明過表達FZD10-AS1可抑制U-2OS細胞的增殖能力。

圖1 FZD10-AS1在骨肉瘤組織和癌旁組織中的表達量Fig.1 Expression level of FZD10-AS1 in osteosarcoma and adjacent tissues

圖2 FZD10-AS1在骨肉瘤細胞株和正常成骨細胞中的表達量Fig.2 Expression level of FZD10-AS1 in osteosarcoma cell lines and normal osteoblast cell

圖3 過表達FZD10-AS1對U-2OS細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of overexpression FZD10-AS1 on the proliferation of U-2OS cells

2.4 過表達FZD10-AS1明顯抑制U-2OS細胞的遷移能力 細胞劃痕實驗結果（圖5）顯示，觀察組U-2OS細胞遷移率明顯少于對照組［（24.52±3.96）%vs.（54.30± 6.06）%，P＜ 0.01］，表明過表達FZD10-AS1可抑制U-2OS細胞的遷移能力。

圖4 過表達FZD10-AS1對U-2OS細胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of overexpression FZD10-AS1 on the migration of U-2OS cells

2.5 生物信息學軟件預測FZD10-AS1互補結合的下游miRNA及基因 采用LncBase Predicted v.2軟件預測顯示：FZD10-AS1可與miR-337-3p互補結合；PITA和starBase V2.0軟件預測顯示，miR-337-3p可與GPD1 mRNA互補結合。見圖5。

圖5 生物信息學軟件預測FZD10-AS1互補結合情況Fig.5 Bioinformatics software predicts FZD10-AS1 complementarity

2.6 過表達FZD10-AS1降低或升高U-2OS細胞中miR-337-3p和GPD1 mRNA表達量 qRT-PCR檢測結果顯示，觀察組U-2OS細胞中miR-337-3p mRNA表達量明顯低于對照組［（1.02±0.11）vs.（0.22±0.06），P＜0.01］，GPD1 mRNA表達量明顯高于對照組［（1.00 ± 0.13）vs.（5.90± 0.52），P＜ 0.01）］，表明過表達FZD10-AS1可下調miR-337-3p mRNA的表達，進而促進GPD1 mRNA的表達。

2.7 過表達FZD10-AS1對GPD1蛋白表達的影響Western Blot檢測結果（圖6）顯示，過表達FZD10-AS1后，GPD1蛋白表達量上調，上皮細胞表型E-cadherin表達升高，間質細胞表型ZEB-2表達降低，細胞周期調控蛋白CDK7、Cyclin H的表達降低。

圖6 過表達FZD10-AS1對U-2OS細胞GPD1相關蛋白表達的影響Fig.6 Effect of high-expressed FZD10-AS1 on the expression of GPD1 protein and related proteins in U-2OS cells

3 討論

可通過多種作用機制如染色質修飾、基因組印跡、轉錄水平、轉錄后水平調控基因的表達［8-10］。許多 lncRNA 如 EPIC1、LINC00152、XIST、FBXL19-AS1、MIAT、MIR100HG被發現在骨肉瘤組織中過表達或低表達，在骨肉瘤中發揮促癌作用或抑癌作用［11-17］。FZD10-AS1是一種新發現的lncRNA，本研究顯示FZD10-AS1在骨肉瘤組織中的表達量較癌旁組織明顯減少，在骨肉瘤中的表達量較正常成骨細胞明顯較少，表明FZD10-AS1在骨肉瘤中低表達可能與骨肉瘤的發生有關。本研究通過上調骨肉瘤U-2OS細胞中FZD10-AS1的表達，FZD10-AS1可抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移能力。

LncRNA發揮作用的主要機制是lncRNA作為miRNA“海綿”，競爭性結合并抑制miRNA的活性，降低miRNA對下游基因mRNA的干擾作用，從而促進下游基因mRNA的翻譯［18-19］。采用LncBase Predicted v.2軟件預測顯示，FZD10-AS1可與miR-337-3p互補結合；PITA和starBase V2.0軟件預測顯示，miR-337-3p可與甘油-3-磷酸脫氫酶1（Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase 1，GPD1）mRNA 互補結合。有研究表明，miR-337-3p在骨關節炎中具有促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用［20］。miR-337-3p可能與細胞的增殖能力密切相關，可能具有促癌基因的作用。GPD1基因位于染色體12q13.12上，以往的研究認為GPD1蛋白是連接碳水化合物和脂質代謝的關鍵因素，其表達異常可引起三酰基甘油合成改變，在高三酰甘油血癥、肝纖維化和脂肪性肝炎等疾病中發揮重要作用［21］。近年來，GPD1蛋白在腫瘤發生發展的研究成為熱點。ZHOU等［22］報道，GPD1蛋白在乳腺癌組織和細胞株中呈低表達，GPD1蛋白的低表達與乳腺癌患者的不良預后明顯相關，過表達GPD1可明顯抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。GPD1蛋白可發揮明顯的抑癌基因作用。本研究發現，轉染表達FZD10-AS1的質粒可明顯下調骨肉瘤細胞中miR-337-3p的表達，而miR-337-3p的表達降低能明顯促進GPD1基因的表達，表明FZD10-AS1可能通過“海綿作用”下調miR-337-3p，間接促進GPD1基因的表達的表達，從而抑制骨肉瘤的增殖和遷移。上皮間質轉化過程是腫瘤細胞發生轉移的關鍵機制，即細胞的上皮細胞表型經重新編程為間充質表型［10］。本研究發現，GPD1基因表達上調后，上皮細胞表型E-cadherin表達升高，間質細胞表型ZEB-2表達降低，表明U-2OS細胞的遷移能力降低；細胞周期調控蛋白CDK7、Cyclin H的表達降低，表明U-2OS細胞增殖能力降低。本研究的不足之處在于沒有在體內驗證FZD10-AS1對骨肉瘤增殖和遷移的影響，這是本研究下一步研究的重點。

綜上，FZD10-AS1在骨肉瘤組織和骨肉瘤細胞株中表達降低。在U-2OS細胞中，過表達FZD10-AS1可通過降低miR-337-3p的表達間接促進GPD1基因的表達，抑制骨肉瘤U-2OS細胞的增殖和遷移能力，對FZD10-AS1的研究對發現骨肉瘤潛在治療靶點可能具有重要臨床意義。