坎地沙坦酯對酒精性肝纖維化小鼠TGF-β1/Smads信號通路的影響

徐旭東 段光琦 劉潔 楊輝 錢葉本

1安徽醫科大學第一附屬醫院（合肥230022）；2皖南醫學院弋磯山醫院（安徽蕪湖241001）

酒精性肝纖維化（alcoholic liver fibrosis，ALF）是酒精性肝病（alcoholic liver diseases，ALD）的最常見形式，為肝硬化的前驅期［1］。研究［2］表明，死于肝硬化的患者約50%由ALF引起。然而，ALF病變隱匿且無有效的診斷方法，臨床發現時多處于嚴重的肝纖維化期。目前臨床認為ALF尚可逆轉，但肝硬化和肝癌則不可逆轉［3-4］。因此，預防肝纖維化進展為肝硬化是主要的治療策略。但ALF進展的機制尚不完全清楚。研究［5-6］表明，轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）在臟器纖維化病理過程中發揮關鍵作用，并通過活化其下游Samd信號發揮生物學功能。研究［7］證實，坎地沙坦能在組織學上誘導肝纖維化改善，但其具體作用機制尚缺乏基礎研究證實。本研究旨在用坎地沙坦酯干預ALF小鼠模型，檢測小鼠肝臟病理組織學改變及TGF-β1/Smads信號通路關鍵分子表達水平的變化，探究坎地沙坦酯改善ALF的可能機制，為臨床治療ALF提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性C57小鼠42只，體質量（20.5±2.25）g，10周齡。動物由南京醫科大學南京生物醫藥研究院提供，許可證號：SCXK（蘇）2015-0001，動物在皖南醫學院附屬弋磯山醫院實驗室飼養［溫度：（22.0 ± 1）℃，濕度：（55.0 ± 1）%］。本實驗小鼠有關所有操作經皖南醫學院倫理委員會批準。

1.2 實驗儀器 光學顯微鏡（德國，卡爾·蔡司），離心機（德國，艾本德），電泳儀，PCR擴增儀（加拿大，劉梅克斯），酶標儀（美國，賽默飛），切片機，包埋機。

1.3 實驗試劑 乙醇、CCl4、AST、ALT和TG ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），天狼星紅染色試劑盒（上海信帆生物科技有限公司），橄欖油（南京道斯夫生物科技有限公司），兔抗小鼠TGF-β1，Smad3單克隆抗體（上海鈺博生物科技有限公司），山羊抗兔二抗（北京百奧萊博科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、建模及干預 42只小鼠隨機分為空白對照組（n=8）和ALF模型組（n=34），ALF小鼠模型按照文獻［8］中的方法造模，模型組給予Lieber-Decarli酒精飲食（能量：30%酒精，35%脂肪，18%蛋白質，10%碳水化合物），從Lieber-Decarli飲食的第九周喂食5次，每周加1次25%CCl4注射［0.4 mL/（kg·d）］，空白對照組接受非酒精性飲食（能量：35%脂肪，18%蛋白質，47%碳水化合物）和等量的生理鹽水腹腔注射，小鼠單籠飼養以調整所有動物攝入能量相等，模型構建共91 d。成功構建ALF模型后，將ALF模型組中的24只小鼠（10只處死以確定ALF模型的建立）隨機分為模型對照組、陽性對照組和實驗組3組。模型對照組給予非酒精飲食和蒸餾水飼養，陽性對照組給予非酒精飲食和蒸餾水飼養，并給予水飛薊素片干預［9-10］（0.36 mg/g），實驗組給予非酒精飲食和蒸餾水飼養，并給予坎地沙坦酯干預，劑量按照動物實驗給藥劑量換算表換算為小鼠劑量［11］（0.021 mg/g），共干預30 d。

1.4.2 取材、切片和染色 過度麻醉處死小鼠，解剖分離小鼠肝臟，用預冷的生理鹽水漂洗2～3次，切取部分置于-80℃保存，再切取約1 cm2肝組織投入40 g/L的多聚甲醛中4℃固定24 h以上。固定好的組織梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm連續切片，并進行HE和天狼星染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.4.3 血漿中ALT、AST和TG水平的檢測 干預完成后，麻醉小鼠，腹主動脈取血4 mL；并加入含有60 μL 10%EDTA和80 μL抑肽酶的無菌離心管中混勻，3 000 r/min離心15 min，分離血漿。取上清液于-80℃保存。ALT、AST和TG檢測嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作。檢測完成后，采用Origin 16.0軟件進行標準曲線擬合，并確定曲線擬合方程，計算樣本各指標濃度值進行統計分析。

1.4.4 肝臟指數 肝臟指數參照文獻［8］中的計算方法：

1.4.5 Western blot檢測蛋白水平 將收集的小鼠肝組織置于冰上，并剪碎。加入適量蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，取上清、分裝。BCA法測定樣品蛋白濃度，加入1/4蛋白體積的Buffer緩沖液混勻，加熱變性，-20℃保存。每個泳道加入等量的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，用PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，分別加入相應一抗 anti-TGF-β1（1∶1 000），anti-Smad3（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；TBST清洗 3次，加入相應二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL化學發光試劑盒顯影。使用Amersham Imager 600采集圖像，Image Lab V5.10軟件分析，樣品蛋白與β-actin灰度值比為樣品待測蛋白相對表達量。

1.4.6 熒光定量PCR檢測TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA表達情況 Trizol法提取肝組織中總RNA，測定RNA純度和濃度。按照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄cDNA，反應體系：純水10 μL，1×Buffer緩沖液10 μL，dNTP Mix 1 mL，上游引物 50 pmol，下游引物 50 pmol（序列見表 1），25 mmol/L MgSO42 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，Tfl DNA Polymerase 1 μL。95℃ Tag酶活化2 min，95℃變性15 s，60 ℃退火，循環 40 次。2-△△Ct法計算 TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.5 實驗觀察指標 （1）HE和天狼星紅染色后，光鏡下觀察局部組織病理變化；（2）血清ALT、AST和TG水平；（3）肝臟指數；（4）Western blot檢測局部組織中TGF-β1和Smad3 蛋白水平變化；（5）RT-PCR檢測局部組織中TGF-β1mRNA和Smad3 mRNA表達水平。

1.6 統計學方法 用SPSS 24.0軟件進行統計分析，所有數據均用（）表示。空白對照組與模型對照組比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用levene法進行方差齊性檢驗，方差齊時，實驗組、陽性對照組和模型組間比較采用單因素方差分析，若單因素方差分析有統計學意義，實驗組和陽性對照組與模型對照組比較采用LSD法，組間兩兩比較采用SNK法（q檢驗）。方差不齊時，采用Welch法進行近似方差分析；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HE和天狼星紅染色觀察 HE染色可見，空白對照組肝細胞形狀正常，靜脈區可見少量炎性細胞。模型對照組肝組織正常結構破壞，肝細胞中存在大量炎性細胞浸潤、出血和壞死，氣泡樣脂肪變性和排列紊亂的肝細胞；天狼星紅染色可見靜脈區較多的膠原沉積；陽性對照組和實驗組可見明顯減少的炎性細胞，少量出血和膠原沉積，肝細胞的排列明顯改善（圖1、2）。

圖1 蘇木精-伊紅染色結果Fig.1 Hematoxylin&eosin staining results

圖2 天狼星紅染色結果Fig.2 Sirius red staining results

2.2 坎地沙坦酯對小鼠血清生化指標的影響ELISA檢測結果表明，模型對照組小鼠血清ALT、AST和TG顯著高于空白對照組、陽性對照組和實驗組。統計分析表明，模型對照組血清ALT、AST和TG水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；陽性對照組和實驗組血清ALT、AST和TG水平顯著低于模型對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；陽性對照組血清ALT、AST和TG水平與實驗組差異無統計學意義（P＞0.05,圖3A、B）。

2.3 小鼠肝指數的變化 統計結果表明，模型對照組小鼠肝臟指數顯著高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；陽性對照組和實驗組肝臟指數顯著低于模型對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；陽性對照組肝臟指數和實驗組差異無統計學意義（P＞0.05，圖3C）。

圖3 坎地沙坦酯對小鼠血清ALT、AST和TG的影響和肝臟指數變化Fig.3 The effects of candesartan on serum ALT，AST and TG in mice and changes in liver index

2.4 肝組織中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平的變化 RT-qPCR檢測結果顯示，模型對照組中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平顯著高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；陽性對照組中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平明顯低于模型對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；陽性對照組中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平與實驗組差異無統計學意義（P＞0.05，圖4 A、B）。

2.5 肝組織中TGF-β1和Smad3蛋白表達水平的變化 Western blot檢測結果顯示，模型對照組TGF-β1和Smad3蛋白表達水平顯著高于空白對照組，差異有統計學（P＜ 0.01）；陽性對照組TGF-β1和Smad3蛋白表達水平明顯低于模型對照組，差異有統計學（P＜0.05）；陽性對照組 TGF-β1和Smad3蛋白表達水平與實驗組差異無統計學意義（P＞ 0.05，圖5A、B）。

3 討論

ALD是一個極具挑戰的全球性健康問題，常導致沉重的醫療負擔，并對患者生命造成極大危害。ALF作為ALD病理進程的一個關鍵階段，也是目前臨床認為能夠可逆轉的關鍵階段。因此，對ALF發病機制和潛在有效治療藥物的研究在本領域備受關注。最近，研究［12］表明，在慢性肝損傷中血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，ANGⅡ）產生過多從而刺激肝星狀細胞活化有助于纖維化。此外，ANGⅡ阻斷劑在丙肝患者中顯示出抗纖維化的作用［13-15］。臨床觀察［7］表明，新型 ANGⅡ型受體阻斷劑坎地沙坦對ALF有緩解作用，但這類藥物緩解肝纖維化的具體作用機制尚無相關研究證實。本實驗目的在于通過構建ALF小鼠模型，用坎地沙坦酯干預ALF小鼠，觀察干預后小鼠肝組織病理變化特征、肝臟指數、血清相關生化指標及TGF-β1/Smads信號通路相關分子的變化，以探究坎地沙坦酯對ALF的可能作用機制，為其臨床應用提供科學依據。

圖4 肝組織中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平的變化Fig.4 The changes of TGF-β1 mRNA and Smad3 mRNA levels in liver tissues

圖5 肝組織中TGF-β1和Smad3蛋白表達水平的變化Fig.5 The changes of TGF-β1 and Smad3 protein expression levels in liver tissues

深入研究ALF的前提是構建理想的ALF動物模型，理想的病理模型應該與人類疾病有相似的病理生理學特征。自由覓食Lieber-Decarli酒精飲食模型已被廣泛地用于ALF的動物模型構建［16］，但單獨使用酒精難以在實驗條件下誘導動物肝纖維化［17］。因此，在本研究中，采用慢性酒精處理并伴隨節點CCL4腹腔注射的“雙擊模型”［18］。實驗結果表明，在實驗中采用Lieber-Decarli酒精液體飲食聯合在最后5周腹腔注射CLL4的方法，ALF模型成功構建。病理變化和人類ALF相似［19］，包括脂肪變性、肝細胞損傷、細胞外周纖維化和膠原纖維的沉積。

TG主要在肝臟中合成、分泌和分解代謝，TG的積聚在慢性肝損傷中發揮重要作用［20-21］。因此，肝功能受損導致脂肪酸向肝臟轉移，導致肝臟中TG含量增加［22］。結果表明，模型對照組TG水平高于空白對照組、陽性對照組和實驗組，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。TONG等［23］研究表明，酒精引起的肝臟脂肪變性包括細胞溶質脂滴內過多的脂肪積聚，主要是TG。這表明模型構建符合要求；實驗組TG水平與陽性對照組差異無統計學意義（P＞0.05），這表明坎地沙坦酯對酒精誘導的肝細胞損傷有保護作用。肝細胞膜結構和功能受損后，ALT和AST溢出，大量滲透到血液中，增加血清ALT和AST［24］。在一定程度上反映了肝細胞損傷的程度。因此，血清ALT和AST升高被認為是判斷肝損傷嚴重程度的重要且敏感指標［25］。結果表明，模型對照組ALT和AST水平高于空白對照組、陽性對照組和實驗組，差異具有統計學意義；實驗組ALT和AST水平無明顯差異。上述結果表明，坎地沙坦酯對酒精誘導的肝細胞損傷具有顯著的保護作用。

TGF-β1是一種多功能細胞因子，在細胞生長分化、細胞外基質合成及損傷修復中發揮重要作用［26］。在哺乳動物體內，TGF-β分子主要含有TGF-β1、TGF-β2和 TGF-β3 3種分子亞型。其中TGF-β1是目前公認的最重要的促纖維化因子之一［27］。研究［28］證實，TGF-β1 參與所有肝纖維化病理過程的關鍵環節。實驗結果表明，與空白對照組比較，模型對照組TGF-β1蛋白表達水平和TGF-β1 mRNA水平均顯增高，差異具有統計學意義；此外，模型對照組TGF-β1蛋白表達水平和TGF-β1 mRNA水平顯著高于陽性對照組和實驗組，差異具有統計學意義；陽性對照組和實驗組TGF-β1蛋白表達水平和TGF-β1 mRNA水平無明顯差異。上述結果表明，坎地沙坦酯能夠降低ALF小鼠模型肝臟中TGF-β1的表達，從而發揮抗肝纖維化作用。

Smad轉錄因子是TGF-β細胞因子家族的關鍵介質，Smad蛋白的可逆磷酸化在調節其功能過程中發揮關鍵作用［29］。參與TGF-β信號途徑的受體激活型Smads（Smad2和Smad3）可直接絲氨酸化與TGF-β 結合的 TGF-β RI末端羥基集團［30］，TGF-β RI介導的Smad3和Smad2的磷酸化誘導共有配體Smad4與它們結合，然后移位到細胞核內激活特定的基因轉錄而發揮調節作用［30］。結果表明，模型對照組Smad3蛋白表達水平和Smad3 mRNA水平顯著高于空白對照組、陽性對照組和實驗組，差異具有統計學意義；陽性對照組Smad3蛋白表達水平和Smad3 mRNA水平與實驗組無明顯差異。實驗結果表明，坎地沙坦酯可以降低AFL小鼠肝組織Smad3的表達，從而改善肝纖維化。

綜上所述，坎地沙坦酯能夠改善ALF小鼠肝組織炎性浸潤、出血、壞死和纖維化程度，降低ALF小鼠血清ALT、AST和TG水平，并降低TGF-β1和Smad3的表達。坎地沙坦酯改善ALF的作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路有關，明確坎地沙坦酯改善肝纖維化的具體機制需進一步研究。