Talin2通過Caspase3信號通路調控乳腺癌細胞侵襲

董奕裕 黃曉文 李建蘭

1浙江省榮軍醫院實驗室（浙江嘉興314000）；2武警海警總隊醫院檢驗科（浙江嘉興314000）

腫瘤細胞自身的侵襲力和轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因［1-2］。位于腫瘤細胞周圍的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是腫瘤微環境的基本組成部分，腫瘤細胞與ECM黏附，通過ECM的降解達到轉移，同時也為腫瘤生長提供必要的生長因子［3］。Talin直接與β-整合素細胞質尾部結合，然后通過其肌動蛋白結合域直接連接整聯蛋白與細胞骨架［4］，對腫瘤的生長和轉移起著至關重要的作用［5］。在脊椎動物中有兩個Talin基因 TLN1和 TLN2，編碼 Talin1和 Talin2，Talin2與Talin1有74%的同源性，Talin1可調節粘著斑（focal adhesion，FA）動力學、細胞遷移和細胞侵襲［6-7］；最近的研究［8］表明Talin2 knockdown能抑制肝癌細胞的遷移，但關于Talin2在腫瘤侵襲和轉移中的作用機制目前還不清楚。本研究擬通過Talin2 shRNA慢病毒感染MDA-MB-231細胞構建Talin2 knockdown穩定細胞系，研究Talin2對MDA-MB-231細侵襲的影響，分析Talin2通過細胞凋亡途徑在乳腺癌發生和發展中的作用和機制，為乳腺癌診斷和治療提供新的方法和依據。

1 材料和方法

1.1 主要細胞、試劑 細胞株MDA-MB-231由溫州醫科大學檢驗與生命科學學院實驗室保存；質粒由該實驗室提供；胎牛血清、DMEM培養基購自Gibco；LipofectaminTM2000均購自 Invitrogen公司；Talin2轉染細胞株通過嘌呤霉素篩選。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及穩定細胞系的建立 按照lipofectamintm 2000轉染試劑產品操作手冊進行，以pLentiLox3.7慢病毒核心空載體和包裝質粒VSVG、RSV-REV和pMDLg/pRRE按一定比例混合，采用脂質體共轉染慢病毒系統轉染293T細胞，于37℃、5%CO2培養48～72 h。將收集的病毒微粒感染乳腺癌細胞MDA-MB-231，并過夜培養。用1 mg/mL嘌呤霉素作用于感染的細胞20 d，篩選穩定表達慢病毒shRNA空載和Talin2 shRNA的細胞系

1.2.2 免疫組織化學染色 采用兩步法對組織切片行免疫組化染色。樣品組織經固定、石蠟包埋后，4 μm厚度切片，50℃烘烤4 h，經脫蠟、脫水，雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液中微波抗原修復8 min，山羊血清室溫孵育封閉1 h。Talin2（1∶150）室溫孵育1 h，聚合物增強劑室溫孵育20 min，酶標抗兔聚合物室溫孵育20 min，常規DAB顯色。以磷酸緩沖液PBS代替一抗作為純陰性對照組。

1.2.3 體外檢測侵襲實驗 將細胞在無血清的培養基中饑餓培養12～24 h，用胰蛋白酶消化各組細胞，再用無胎牛血清的DMEM培養基制成濃度為10×105/mL細胞懸液。在小室中加入600 μL含有10%胎牛血清的DMEM培養基，在上室上加入各組細胞懸液100 μL/孔，在5%CO2的培養箱中37℃培養24 h。上室中培養液去除，取出膜，用棉簽輕輕將上室多余的細胞擦去，PBS清洗1次后用70%的甲醇固定膜45 min，結晶紫染色5 min。用顯微鏡下觀察遷徙至膜上的細胞，計算5個高倍鏡視野中的細胞數總和，計算穿膜細胞數，細胞侵襲能力的強弱根據穿膜細胞數來評價。

1.2.4 Western Blot檢測 收集細胞RIPA裂解液提取蛋白，用碧云天BCA試劑盒進行蛋白濃度測定，加入30 μg樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后，取出PVDF膜，甲醇浸泡活化1 min，放入5%脫脂奶粉中封閉1.5 h。加入山羊抗兔，Talin2 抗體（1∶1 000），Caspase3（1∶1 000）和 Phospho-caspase3（1∶1 000），Caspase8（1∶1 000）和 Phospho-caspase8（1∶1 000），PARP（1∶1000）和 cleaved-PARP（1：1 000），山羊抗小鼠抗體α-（1∶1 000），羊抗兔抗體GAPDH（1∶1 000）4℃孵育過夜（這些抗體都購置于abcam公司），TBST洗膜8 min×3次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，經化學發光自顯影方法進行成像。

1.2.5 Hoechst染色檢測細胞凋亡 使用細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒（Hoechst Staining Kit，碧云天公司）檢測細胞凋亡情況。將蓋玻片置于70%乙醇中浸泡5 min，用PBS洗滌3次，用DMEM培養液洗滌1次。將蓋玻片置于六孔板內，接種細胞培養過夜，使細胞融合度約為50%～80%。加500 μL固定液，固定10 min。棄固定液，用PBS洗2次，每次3 min。加入Hoechst 33258染色液500 μL，輕輕晃動染色5 min；倒掉染色液，用PBS沖洗2次，每次3 min，吸盡多余的液體；滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液；波長352～461 nm左右觀察細胞核形態，可見已發生凋亡的細胞核呈藍色致密光亮。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。計量資料的數據以均數±標準差表示，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）。以P＜0.05為有差異的統計學意義。

2 結果

2.1 Talin2在腫瘤組織和細胞中的表達 選取浙江省榮軍醫院新鮮的臨床乳腺癌標本20例，通過4%多聚甲醛（PFA）固定至少48 h后采用免疫組化（IHC）方法檢測Talin2在不同乳腺癌組織中表達水平高低。如圖1C所示：在腫瘤組織中Talin2（黃褐色區域）比正常/癌旁組織中表達高，說明Talin2在乳腺癌發生、發展過程中具有一定的作用（圖1C）。

重組慢病毒Talin2感染MDA-MB-231細胞后，用嘌呤霉素對感染細胞篩選。感染3～4周后收集感染組細胞擴大培養，建立穩定表達Talin2 knockdown的MDA-MB-231細胞系。通過WB檢測Talin2在knockdown細胞中的表達水平，發現與對照組MDA-MB-231相比，實驗組Talin2的蛋白表達量明顯降低；表明Talin2 knockdown細胞系構建成功，為后續的實驗奠定了基礎（圖1A、1B）。

圖1 Talin2在MDA-MB-231細胞和乳腺癌組織中的表達水平Fig.1 Expression levels of Talin2 in MDA-MB-231 cells and breast cancer tissues

2.2 Talin2 Knock Down抑制了MDA-MB-231細胞侵襲能力 為了探討Talin2在乳腺癌細胞侵襲中的作用，采用Transwell法比較了感染Talin2 shRNA和對照shRNA的MDA-MB-231細胞的侵襲情況。3組細胞在相同條件下連續培養48 h后，鏡下隨機選取視野拍照并統計穿過濾膜的細胞數目。結果表明，與對照組相比，Talin2基因敲除顯著降低了MDA-MB-231細胞的侵襲性。具體來說，侵襲Talin2 shRNA1和shRNA2的敲除細胞數量分別只有對照細胞的32%和26%（圖2）。因此，內源性Talin2的缺失抑制了MDA-MB-231細胞的侵襲能力。

2.3 Talin2 knockdown促進MDA-MB-231細胞發生凋亡 腫瘤的發展與細胞增殖和凋亡之間的平衡紊亂有關，細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性會增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，用Hoechst染色法檢測Talin2基因敲除后MDAMB-231細胞的形態學變化，對照組細胞的凋亡率是（8.07±0.933）%，Talin2 knockdown細胞凋亡率分別為（25.23±1.398）%和（29.73±1.452）%，兩者較空白對照組分別升高了大約65%，且差異有統計學意義（P＜0.001，圖3）。結果表明Talin2 knockdown明顯導致細胞凋亡數目增加，促進MDA-MB-231細胞凋亡。

圖2 Talin2基因敲除抑制了MDA-MB-231細胞的侵襲Fig.2 Talin2 knockdown inhibited invasion of MDA-MB-231cells

圖3 Talin2shRNA誘導MDA-MB-231細胞的凋亡Fig.3 Talin2 shRNA induces apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.4 Talin2 knockdown影響細胞凋亡信號通路相關蛋白表達水平 本研究采用Western Blot對腫瘤細胞凋亡信號通路中的相關蛋白表達水平的檢測來進一步分析Talin2 knockdown誘導腫瘤細胞凋亡的原因，凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是已經確定半胱天冬蛋白酶（Caspase）在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程，細胞凋亡受到嚴格調控，在正常細胞Caspase處于非活化的酶原狀態，凋亡程序一旦開始，Caspase被活化后發生凋亡蛋白酶的層疊級聯反應，發生不可逆的凋亡。本實驗在蛋白水平上檢測了Caspase3、Caspase8及Caspase3作用底物多聚（ADP-核糖）聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］。表達量如圖4所示，Caspase3、Caspase8總的表達量在MDA-MB-231對照組細胞、Talin2 knockdown組細胞沒有發生變化，但是通過基因敲除后，Talin2 knockdown細胞組與對照組MDA-MB-231細胞相比Caspase3磷酸化水平表達水平顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.001）；同樣通過基因敲除后，Talin2 knockdown細胞Caspase8磷酸化水平明顯高于正常MDA-MB-231對照組細胞，差異具有統計學意義（P＜0.05）；Caspase3的作用底物PARP在MDA-MB-231對照組細胞、Talin2 knockdown組細胞總表達量沒有發生變化，但是通過基因敲除后，Talin2 knockdown細胞cleaved-PARP水平明顯高于正常MDA-MB-231對照組細胞，差異具有統計學意義（P＜0.05）；這提示跨膜蛋白Fas或腫瘤壞死因子（TNF）誘導的凋亡起始分子Caspase8，直接或間接激活下游效應分子Caspase3，進而誘導凋亡的發生［9］，而激活的Caspase3又切斷PARP等再激活核酸內切酶（endogenous nuclease DNase），使DNA有控降解成片斷化斷裂，促進腫瘤細胞凋亡。

3 討論

惡性腫瘤作為危害全球人類健康的疾病，其發病率、死亡率一直呈持續上升趨勢；而腫瘤細胞的浸潤性生長和轉移是癌癥治療的主要障礙，也是導致癌癥相關死亡率的主要因素［10］。惡性腫瘤轉移的分子調控機制不甚明了導致大多數惡性腫瘤治療難以治愈。細胞外基質是腫瘤微環境的主要組成部分，含有腫瘤生長依賴的多種生長因子和細胞因子［11］。

圖4 Talin2敲低對MDA-MB-231細胞系中凋亡信號傳導途徑相關蛋白表達水平的影響Fig.4 Talin2 knockdown effects on expression levels of apoptotic signaling pathway associated proteins in MDA-MB-231 cell lines

Talin是細胞外基質、整合素和細胞骨架中的關鍵分子［12］，整合素由非激活狀態變成激活狀態主要是由于胞內Talin蛋白所致，在原發性腫瘤及其轉移中，整合素與促纖維增生反應期間沉積的膠原結合并加速腫瘤細胞增殖，存活，化療耐藥和轉移［13］。Talin有兩個基因，分別編碼Talin1和Talin2［14］。人們對Talin2在腫瘤侵襲和轉移中的作用機制研究過程中的作用知之甚少［15］。

為探討Talin2在乳腺癌細胞中的作用，構建了Talin2基因敲除穩定表達細胞系，并對其功能進行了檢測。用WB檢測Talin2在Talin2 knockdown的MDA-MB-231細胞中蛋白水平，結果顯示穩定的Talin2 knockdown細胞系明顯下調，另外，為了探討Talin2在乳腺癌細胞侵襲中的作用，采用Transwell法，結果表明，Talin2 knockdown細胞穿越Transwell小室的細胞數目顯著減少，因此，內源性Talin2的缺失抑制了MDA-MB-231細胞的侵襲能力說明Talin2 knockdown能抑制MDA-MB-231細胞的侵襲能力［16］。

細胞凋亡，即程序性細胞死亡。細胞凋亡可通過半胱天冬酶（cysteiny asparatate specific proteinases，Caspase）的蛋白酶家族介導的外源性或內源性途徑觸發［17］；Caspases是細胞凋亡機制的核心，因為它們既是細胞死亡的起始物（Caspases2、Caspases8、Caspases9和 Caspases10，主要負責凋亡途徑的開始）和執行者（Caspases3、Caspases6和Caspases7，負責細胞成分的明確分裂）。起始Caspases作為非活性蛋白（酵母菌或原半胱天冬酶）產生后，通過自蛋白水解酶自動激活，這是一個通過它們與特定的結合分子相互作用而促進的過程［18］。Caspase在正常情況下以無活性的前體形式合成與貯存，一旦被激活，啟動Caspases就會切斷執行體Caspases，執行特定細胞底物的關鍵性分裂，最終導致凋亡細胞死亡［19］。兩種凋亡途徑融合激活效應器是Caspase3，激活導致細胞的形態學和生化改變等細胞凋亡特征，最終使細胞凋亡。實際上，腫瘤是一種發生在細胞增殖和凋亡過程不平衡狀態的疾?。?0］。筆者對不同組的MDAMB-231細胞用Hoechst染色法檢測Talin2敲除后MDA-MB-231細胞的形態學變化，如細胞核變得凝集，大小變小，染色質部分縮聚成小球形或新月形，表明細胞發生凋亡，結果顯示：對照組細胞的凋亡率是（8.07±0.933）%，Talin2 knockdown細胞凋亡率分別為（25.23±1.398）%和（29.73±1.452）%，兩者較對照組升高了大約65%（P＜0.001）。結果表明Talin2 knockdown明顯促進乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡。另外，本研究同時檢測了knockdown和對照組中磷酸化Caspase-3水平，結果顯示Talin2 knockdown組顯著高于對照組。目前Caspase-3的作用底物有DNA-PK、PARP、GDT酶解離抑制因子（D4-GDl）等，大多數情況下，116 kDa的PARP被蛋白酶切割以后，細胞便進入凋亡途徑，最終導致細胞凋亡。PARP是Caspase底物，也被稱為死亡底物（deathsubstrate），被認為是細胞凋亡的重要指標，所以Caspase3能切割PARP產生85 kDa的凋亡片段，通過WB檢測knockdown和對照組中剪切的PARP指標來反映Caspase3激活的水平，本研究結果顯示Talin2 knockdown組顯著高于對照組。這表明了Talin2 knockdown激活Caspase3并引起級聯反應激活，從而引起細胞凋亡。這也驗證了我們假設Talin2基因敲除激活Caspase3，然后啟動級聯反應，導致細胞凋亡。

綜上所述，通過短發夾RNA（shRNA）介導的干擾，建立了Talin2敲除穩定的細胞系，Talin2基因敲除顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長、轉移能力和侵襲性，并導致凋亡標志物的下調、裂解Caspase3和聚ADP-核糖聚合酶的磷酸化［21］，促進細胞凋亡。Talin2水平升高可能抑制細胞死亡并增加轉移［22］。這些結果為乳腺癌的診斷和治療提供了新的靶點和依據。