深圳急性腸胃炎住院患兒中人副腸孤病毒臨床和流行病學特征分析

祝亞楠 張海龍 陳龍 姚相杰 楊洪 韓敏 關心 何雅青 胡貴方

1南方醫科大學公共衛生學院流行病學系（廣州510515）；2深圳市疾病預防控制中心病原生物研究所（廣東深圳518036）

人副腸孤病毒（human parechovirus，HPeV）是一種單股正鏈、無包膜的RNA病毒，屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）人副腸孤病毒屬（Parechovirus），全長約7.3 kb。目前基于VP1序列差異已發現了18種基因型［1］，但VP3/VP1連接區序列也高度變異，也可用于基因分型。HPeV主要通過糞-口和呼吸道途徑傳播，在糞便和呼吸道分泌物樣本中可檢測到病毒脫落，且主要從兒童中分離獲得［2］。HPeV感染后除引起胃腸道及呼吸道癥狀外，還可引發腦炎、無菌性腦膜炎、心肌炎、膿血癥及瑞氏綜合征等嚴重疾病［3］。HPeV感染范圍廣泛，目前已在多個國家報道過該病毒的感染。在國內，自2009年在上海首次報道了HPeV感染［4］，目前僅在少數幾個地區有過報道［5-11］，關于HPeV與急性腸胃炎的研究尤其是關于住院兒童的研究還較少。深圳作為國內最重要的口岸城市之一，人口密度高，流動性強，地處亞熱帶，但目前關于深圳地區急性腸胃炎住院患兒中HPeV的分子流行病學特征尚不清楚。因此，從急性腸胃炎住院患兒糞便標本中檢測HPeV，并分析其型別，以充分認識深圳地區HPeV與急性腸胃炎住院患兒之間聯系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月至2018年12月5歲以下急性腸胃炎住院患兒497例，以嘔吐和腹瀉等消化道癥狀為主訴住院病例，要求病例為發病3 d以內的病例［12］。研究對象來自深圳市疾病預防控制中心感染性腹瀉監測網絡2家哨點醫院，其中男316例，女181例。收集患兒入院前臨床資料，并采集糞便標本，經常規細菌檢測鑒定為陰性，置-80℃冰箱保存待檢。

1.2 核酸提取與HPeV檢測 用Hank′s緩沖液將糞便制成20%混懸液，按照核酸提取試劑盒MagNA pure LC Total Nucleic Acid isolation kit（Roche）說明書要求提取樣本核酸，所提取核酸保存于-20℃待用。根據HPeV 5′端非編碼區設計的引物和探針，采取實時熒光RT-PCR法和Perfect Real Time One-Step Prime Script RT-PCR試劑（TaKaRa）進行HPeV檢測［13］。

1.3 HPeV分型 根據HPeV VP3/VP1連接區的兩對引物，通過巢式PCR和Prime Script One Step RT-PCR試劑（TaKaRa）對HPeV疑似陽性樣本進行基因分型［14］。所獲得的PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，將符合預期大小的PCR產物送到上海生工生物公司雙向測序，測序結果經系統進化分析確定基因型。

1.4 系統進化樹構建和進化分析 使用BioEdit進行序列比對（ClustalW法），采用MEGA 7.0軟件中鄰接法（Neighbor-joining method）建立系統進化樹，進化樹可靠性估計Boot-strap值設定為1000。HPeV參考株來自GenBank中以測序結果作為查詢序列搜索到的核酸相似性最高的同源序列。

1.5 統計學方法 使用EpiData 3.1錄入問卷，核對無誤后使用SPSS 22.0軟件處理數據，采用χ2檢驗、fisher確切概率檢驗、t檢驗方法比較不同特征患兒HPeV陽性率差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 497例患兒中，男316例（63.6%），女181例（36.4%）；患兒月齡最小2個月齡，最大60個月齡，平均月齡（15.3±0.510）個月；2017年、2018年病例數分別為291例、206例。采用實時熒光RT-PCR方法檢測HPeV疑似陽性46例，其中2017年29例，2018年17例。采用巢式PCR成功分型的有41例，陽性率為8.2%（41/497），其中2017年26例，2018年15例。

2.2 性別分布 男性HPeV陽性為24例，陽性率為7.6%（24/316），女性HPeV陽性為17例，陽性率為9.4%（17/181），不同性別HPeV陽性率差異無統計學意義（χ2=0.491，P=0.501），見表1。

2.3 月齡分布 HPeV陽性患兒平均月齡（9.5±1.035）個月，HPeV陰性患兒平均月齡（15.7±0.542）個月，二者差異有統計學意義（t=8.919，P=0.003）。各月齡組間0～6個月患兒HPeV陽性率最高（13.8%），其次為7～12個月（13.3%），25～60個月（4.2%），13～24個月（2.3%），差異有統計學意義（χ2=20.777，P＜0.001）。其中92.7%（38/41）的HPeV陽性患兒月齡＜24個月，見表1。

2.4 時間分布 2017年HPeV陽性率為8.9%（26/291），2018年HPeV陽性率為7.3%（15/206），差異沒有統計學意義（χ2=0.436，P=0.509），見表 1。從月份分布圖看，HPeV感染以炎熱季節多見，夏季（7-10月）為檢出高峰期，其中7月HPeV陽性率最高（26.3%），6月、11-1月有較低的檢出率，2-5月沒有HPeV檢出，見圖1。

2.5 臨床癥狀分析 對所有患兒進行入院調查，其臨床表現常見發熱、腹瀉、嘔吐，見表2。其中HPeV陽性患兒平均體溫（37.3±0.133）℃，HPeV陰性患兒平均體溫（37.1±0.040）℃，體溫分布中中熱患兒HPeV陽性率最高（11.5%），其次為高熱患兒（10.0%）、正常患兒（7.9%）、低熱患兒（7.5%），差異無統計學意義（χ2=0.859，P=0.827）。所有患兒入院前都有腹瀉癥狀，從入院前腹瀉頻率來看，HPeV陽性患兒平均每天腹瀉次數（6.1±0.427）次，HPeV陰性患兒平均每天腹瀉次數（5.7±0.146）次，在腹瀉頻率分布中腹瀉次數大于每天6次患兒HPeV陽性率最高（10.0%），其次為腹瀉次數4～6次/d患兒（7.9%）、腹瀉次數小于每天4次患兒（6.4%），差異無統計學意義（χ2=1.167，P=0.558）。從糞便形狀來看，伴有黏液便患兒HPeV陽性率最高（19.1%），其次為伴有膿血便患兒（16.0%）、水樣便患兒（7.2%），在伴有米泔樣便、鮮血便、膿血便、黑便、糊狀便、蛋花樣便、黃綠稀便中沒有HPeV檢出，差異無統計學意義（χ2=13.044，P=0.159）。497例患兒中，伴有嘔吐癥狀的患兒有211例，HPeV陽性率為4.7%，無嘔吐癥狀的患兒有286例，HPeV陽性率為10.8%，二者差異有統計學意義（χ2=5.969，P=0.015），HPeV陽性患兒入院前平均每天嘔吐次數（5.0±0.829）次，HPeV陰性患兒平均每天嘔吐次數（4.9±0.189）次，差異無統計學意義（t=0.001，P=0.999）。從患兒嘔吐物性狀來看，只在伴有嘔吐胃內容物患兒中檢測到HPeV，HPeV陽性率為4.7%，在嘔吐物為水樣和血樣內容物的患兒中沒有檢測到HPeV，差異有統計學意義（χ2=22.902，P＜ 0.001）。

表1 2017-2018年急性腸胃炎住院患兒基本信息和HPeV檢測結果Tab.1 Demographic characteristics of hospitalized children with acute gastroenteritis during 2017-2018 and detection rate of HPeV 例（%）

圖1 2017-2018年不同月份急性腸胃炎住院患兒HPeV感染情況和每月陽性率分布Fig.1 Seasonality distribution of HPeV infection among hospitalized children with acute gastroenteritis during 2017-2018.The lines indicates the percentage of HPeV-positive samples in each month

表2 HPeV陽性與陰性住院患兒臨床特征比較Tab.2 Comparison of clinical characteristic between HPeV-positive and HPeV-negative hospitalized children 例（%）

2.6 HPeV基因型別的分布 41例樣本中存在HPeV-1（HPeV-1A和HPeV-1B亞型）、3、4、5、6、14六種型別，且以HPeV-1為主要流行型別，HPeV-1B為優勢流行株（56.1%），其次是HPeV-1A（17.1%）。HPeV-3（7.3%），HPeV-4（7.3%）、HPeV-5（4.9%）、HPeV-6（4.9%）和HPeV-14（2.4%）在深圳地區有較低的流行率。此外2017年共檢出6種基因型，包括HPeV-1、HPeV-3，HPeV-4、HPeV-5、HPeV-6和HPeV-14，而2018年只檢出2種基因型，包括HPeV-1和HPeV-4，見表3。

表3 2017-2018年急性腸胃炎住院患兒中HPeV基因型的流行及分布Tab.3 Prevalence and distribution of HPeV genotypes in hospitalized Children with acute gastroenteritis during 2017-2018 例（%）

2.7 系統進化分析 筆者將深圳分離株和從Gen-Bank獲得的HPeV參考株VP3/VP1連接區序列繪制系統進化樹，深圳分離株與參考株具有較高的核苷酸一致性，見圖2。結果顯示：有15株HPeV-1B深圳分離株與參考株FJ840477H/Shanghai/2008和MH921804/Australia/2018進化距離最近，核苷酸相似性范圍為94.9%～98.8%。另有1株HPeV-1B（17-171）分離株與參考株LC143414/Japan/2014進化距離最近，核苷酸相似性為91.4%。有2株HPeV-1B（18-107和18-125）分離株與參考株MG517313/South Korea/2015進化距離最近，核苷酸相似性范圍為96.0%～96.4%。有5株HPeV-1B深圳分離株與參考株FJ763356/Lanzhou/2006和JQ715735/Lanzhou/2009進化距離較最近，核苷酸相似性范圍為93.7%～96.4%。在7株HPeV-1A深圳分離株中，各有3株（17-5、17-157和17-175）、1株（17-4）、3株（17-154、18-99和18-132）分離株分別與參考株MG030372/Australia/2018、JQ715769/Lanzhou/2009和KT591419/Guangzhou/2013進化距離最近，核苷酸相似性范圍分別為93.3%～94.5%、93.7%和93.3%～94.1%。在3株HPeV-3深圳分離株中，17-124、17-130和17-167分離株分別與參考株JQ715760/Lanzhou/2009、FJ763360/Lanzhou/2006和MF576080/Netherland/2012進化距離較近，核苷酸相似性分別為97.6%、96.0%和99.2%。此外有3株HPeV-4（17-180、18-87和18-208）分離株與參考株MH921811/Australia/2018和JQ715767/Lanzhou/2009進化距離較近，核苷酸相似性范圍為93.8%～94.9%。在2株HPeV-5深圳分離株中，17-249和17-231分離株分別與參考株KF489918/Guangzhou/2013和KY067444/Zhejiang/2015進化距離較近，核苷酸相似性分別為91.5%和98.0%。有2株HPeV-6分離株（17-129和17-189）與參考株MH921749/Australia/2018進化距離最近，核苷酸相似性范圍為98.0%～98.4%。還有1株HPeV-14（17-172）分離株與參考株KT591417/Guangzhou/2013進化距離最近，核苷酸相似性為94.9%。

圖2 深圳分離株與HPeV參考株VP3/VP1連接區序列系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on VP3/VP1 junction region of HPeV-positive samples and HPeV prototype strains

3 討論

我國不同地區不同年份以及不同樣本HPeV的檢出率有較大差異，本研究中深圳地區急性腸胃炎住院患兒糞便樣本中HPeV檢出率為8.2%，且2017年與2018年HPeV檢出率差異沒有統計學意義，說明HPeV在深圳地區急性腸胃炎住院患兒中保持比較穩定的感染狀態。此外與其他地區腹瀉住院患兒HPeV檢出率相比，與吉林地區HPeV檢出率（8.8%）相當［10］，低于蘭州地區HPeV檢出率（24%）［5］。與其他地區門診腹瀉患兒 HPeV檢出率相比，高于香港地區HPeV檢出率（2.3%）［6］，低于上海（55.0%）［9］和廣州（13.4%）［11］地區HPeV檢出率。本研究中男女性HPeV陽性率差異無統計學意義，與國內外的研究報道一致［5-6，9，14-15］，說明HPeV感染無性別差異。HPeV陽性患兒與陰性患兒月齡分布有統計學差異，HPeV陽性患兒平均月齡明顯低于陰性患兒月齡，且0～6個月月齡組HPeV陽性率最高，可能這是兒童自身免疫能力尚未完善的時期，感染HPeV的患兒因病情較重而入院治療。血清學資料顯示，90%以上的兒童在兩歲前已感染HPeV［16］，本研究表明深圳地區2歲以下患兒中，約有92.7%的患兒攜帶HPeV。本研究中發現了HPeV感染具有明顯的季節性，其中7月HPeV陽性率最高，與吉林地區研究報道一致［10］，7-10月為檢出高峰期，這一時間分布與國內其他研究報告的分布略有不同，國內其他研究報告的檢測率在7月～8月（上海［9］、蘭州［5］、廣州［11］）和 9-1月（香港［6］）達到高峰。因此國內地區HPeV感染多以炎熱季節多見，這可能主要與炎熱季節降雨量多有關［17］。

臨床癥狀分析顯示，HPeV感染的急性腸胃炎住院患兒的癥狀主要表現在中熱，每天腹瀉頻率＞6次/d，以粘液便為主，常伴有嘔吐，嘔吐頻率平均5次/d，嘔吐物以胃內容物為主。但HPeV陽性患兒較陰性患兒主要表現在嘔吐和嘔吐物性狀存在統計學差異，而其他癥狀與HPeV陰性患兒表現相近，不易區分。說明HPeV可能是引起急性腸胃炎住院患兒嘔吐的病因，尤其是對于嘔吐物為胃內容物的患兒。

研究中共有6種已知型別的HPeV被檢出，HPeV-1為主要流行型別，HPeV-1B為優勢流行株，與其他地區研究報道一致［6，14，18］，因此 HPeV-1B 似乎是導致胃腸道綜合征發生率較高的原因，也有研究表明HPeV-1B常與兒童水樣便急性腸胃炎有關［19］。本研究還發現，在深圳HPeV-1A具有相對較高的檢測率是一個顯著的流行病學特征。此外在深圳地區HPeV-4也常被檢測到，這與鄰近城市廣州［14］和香港［6］非常相似，且這3個地方之間往來頻繁。另一方面，在歐洲［20］和一些亞洲城市［16，18］發現具有較高檢測率的HPeV-3在深圳卻很少被發現。這可能因為HPeV3是引起兒童中樞神經系統感染和膿毒癥的主要基因型［21-22］。值得注意的是，在本研究中，很少報道的HPeV-5、HPeV-6和HPeV-14基因型也有檢測到，說明HPeV存在多種基因型皆可引起患兒急性胃腸炎。

系統進化樹分析結果顯示，41例深圳分離株分別與相應參考株有較高的核苷酸序列同源性，包括流行在亞洲的幾個地區（上海、蘭州、廣州、浙江、日本和韓國）、澳大利亞和荷蘭的參考株，提示HPeV在世界范圍內廣泛傳播。其中大部分深圳分離株與蘭州和廣州來源的參考株有較高的核苷酸一致性，提示HPeV進化具有一定的地域性特征。

綜上所述，本研究發現HPeV在深圳急性腸胃炎住院患兒中保持穩定的感染率，檢測到6種HPeV基因型別可能與急性腸胃炎相關，HPeV炎熱季節檢出率最高，好發于2歲以下患兒，可能是引起急性腸胃炎住院患兒嘔吐胃內容物的病因。本研究首次在深圳地區急性腸胃炎住院患兒中檢測到HPeV，補充了急性腸胃炎住院患兒感染HPeV的流行病學和臨床特征資料，為本地區HPeV的防治提供有益科學依據，有助于進一步明確深圳地區兒童病毒性腹瀉病原譜的構成。但對于HPeV優勢流行株變異趨勢，本研究僅有2年監測數據，還需要對HPeV進行持續監測，以更進一步的研究HPeV在深圳地區的流行情況。