基孔肯雅病毒實驗診斷進展

徐佩佩，丁細霞

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)為單股正鏈RNA病毒，包含2個開放閱讀框，分別編碼4種非結構蛋白(nsP1-4)和5種結構蛋白(C、E3、E2、6K、E1蛋白),根據E1氨基酸同源性被分為ECSA、亞洲、西非3種基因型[1]。CHIKV于1953年首次分離于坦桑尼亞，隨后在非洲、亞洲、歐洲散發，2005年留尼汪島的暴發波及138萬人，出現嚴重腦炎、出血熱而導致死亡率急劇上升，截止2013年基孔肯雅熱(Chikungunya fever,CHIKF)已播散至美洲。患者起病初期主要表現為發熱、頭痛、肌痛、關節痛、皮疹、乏力等非特異性臨床癥狀，與登革病毒(dengue virus, DENV)、寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、黃熱病毒(yellow fever virus, YFV)、西尼羅病毒(west nile virus, WNV)感染早期癥狀相似，均以蚊子為傳播媒介，存在混合感染。且這幾種病毒感染的治療方法不同，尤其是對CHIKF有效的非甾體類抗炎藥被嚴禁于DENV感染，而高水平的炎癥細胞因子使15%～30%的CHIKF患者最終發展成關節畸形甚至死亡[2]。2009年WHO公布的東南亞CHIKV防控指南提出：診斷CHIKF至少具備以下一項：病毒分離陽性、CHIKV IgM抗體陽性、間隔至少3周的CHIKV IgG抗體滴度4倍升高和RT-PCR陽性，可通過噬斑減少中和試驗或血細胞凝集抑制試驗排除阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong-nyong Virus，ONNV)或森林腦炎病毒等其他甲病毒或黃病毒感染[3]。2019年泛美抗風濕聯盟聯合加勒比與安第斯風濕病學會規定確診CHIKF的ELISA或RT-PCR試驗敏感性需高于74.2%且特異性高于88.4%[2]。本文將從病毒分離、血清學抗體檢測、抗原檢測、分子生物學檢測4個方面介紹CHIKF的實驗室診斷進展(表1)。

表1 基孔肯雅熱診斷方法及其特征
Tab.1 Characteristics of diagnosis method for CHIKF

檢測方法標本類型最佳檢測時限優點缺點參考文獻病毒分離血漿、血清,全血或組織發病3 d內診斷金標準;可對病毒株進行溯源需在BSL-3實驗室中進行;對實驗技術及設備要求高;無法早期診斷;敏感性低[4]抗體檢測血清或血漿IgM:發病第4 d到第2個月;IgG:發病第7 d到半年操作簡單、快速;成本低;無需特殊設備,適合大規模篩查與其他甲病毒、黃病毒屬存在交叉;IgM檢測不能區分急性感染與近期感染;無法早期診斷[4][5]抗原檢測血清或血漿發病10 d內早期診斷方法;操作簡單、快速;成本低;適合大規模篩查僅適于早期檢測[6]分子生物學檢測血清、血漿或全血發病第1 d到第8 d早期診斷方法;可用于基因分型設備及價格昂貴;不適合大規模篩查;僅適于早期檢測[4]

1 病毒分離

病毒分離，是一種傳統的檢測技術，仍是目前診斷CHIKF的“金標準”。主要通過將病毒血癥患者的血液或感染組織接種于小鼠腦內或接種于伊蚊細胞系(如C6/36、Aag-2)和其他病變效應明顯的哺乳動物細胞系(如BHK-21，HeLa和Vero細胞)進行分離[3]。不同基因型病毒對各種細胞敏感性存在差異，其中C6/36和BHK-21細胞較適合印度洋譜系CHIKV的分離；Aag-2、HeLa和Vero細胞較適合亞洲基因型CHIKV的分離[7]。盡管病毒分離的特異性高，同時可對所分離病毒株的來源及特征進行鑒定，但其靈敏度低，對實驗技術、條件要求高，需要在生物安全3級實驗室進行，且病毒分離時間長，不適合于CHIKF的快速早期診斷及基層單位的推廣應用。

2 血清學抗體檢測

目前用于檢測CHIKV的抗體方法, 主要包括免疫印跡、間接免疫熒光法、ELISA、血凝抑制試驗(HI)、中和試驗及膠體金免疫層析法。其中,包被抗原的間接ELISA法與檢測IgM 和(或)IgG 的ELISA 捕捉法是檢測CHIKV最常用的抗體檢測方法。

2.1免疫印跡法 2016年，Yang等[8]以重組E2為檢測抗原開發了用于檢測CHIKV IgG的免疫印跡檢測試劑,其靈敏度為83.3%，特異性為96.7%。同年，Verma等[9]將重組E2應用于免疫印跡以檢測10對血清樣本中的CHIKV IgM和IgG，準確率達100%。但由于該方法的操作繁瑣，而很少應用于臨床診斷。2019年泛美抗風濕聯盟聯合加勒比與安第斯風濕病學會發布的共識也未將免疫印跡法納入CHIKV的診斷標準[2]。

2.2間接免疫熒光法 間接免疫熒光法的應用要求具備專業技術人員及相關設備。目前，歐盟已開發出診斷CHIKF的間接免疫熒光商品化試劑盒，該試劑盒在臨床應用中也存在很多問題，部分樣本結果判定困難，主觀意識較強，需要重復檢測樣品較多。但目前美國疾控中心和加勒比公共衛生署對該試劑盒檢測的準確性評估分別為96%和97%[10]。

2.3ELISA法 ELISA是目前最常用于傳染性病原的抗原、抗體檢測方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，操作簡單，適合于大規模篩查。近年來針對CHIKV抗體檢測的間接ELISA法主要以E2蛋白為靶標抗原，但因E2蛋白存在較多的半胱氨酸殘基導致蛋白可溶性差，一般以基因重組的E2蛋白[9,11-12]較常用于抗體檢測。其中，Fumagalli等[12]以重組E2開發的間接ELISA與Mayaro病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、Mucambo病毒和Aura病毒均無交叉反應，可用于Mayaro病毒與CHIKV共同流行區(如巴西等)作為鑒別診斷。美國疾控中心曾對2015年6月之前開發的6種CHIKV IgM捕獲ELISA商品化試劑盒進行評估，發現歐盟和Inbios生產的試劑盒診斷準確率分別為99%和100%，優化后的Abcam試劑盒與疾控中心的診斷結果一致性高達99%，而另外3種試劑盒的敏感性均低于50%[13]。目前，也有報道應用抗C蛋白單抗、E1單抗和E2單抗建立CHIKV IgM和(或)IgG捕獲ELISA法。其中，Damle等[14]首次應用抗C蛋白IgG開發捕獲ELISA以診斷CHIKF，與辛德畢斯病毒無交叉反應；Galo等[15]開發的IgM捕獲ELISA和競爭法ELISA均與DENV無交叉反應。為了進一步降低成本與加速檢測，Theillet等[16]把CHIKV IgM捕獲ELISA法的原理應用于由自黏塑料與玻璃纖維紙組成的紙基分析裝置，上樣8～10 min后，檢測結果可由手機讀出，與ONNV無交叉反應，但與DENV和ZIKV存在交叉反應。為避免不同操作者采用手機讀取結果引起的偏差，Wang等[17]采用自制閱讀器開發了可同時診斷CHIKV和DENV IgM及IgG的側向層析試驗，診斷性能較市售快速診斷試劑盒高。

3 抗原檢測方法

目前尚未有商品化的CHIKV抗原檢測試劑盒，但關于CHIKV的抗原診斷方法的研究報道不少。由于E1為CHIKV相對保守的結構蛋白，因此，檢測患者血清中E1抗原成為CHIKV抗原檢測試劑研究的靶標。2015年，Okabayashi等[18]用E1單抗開發了診斷CHIKF的膠體金免疫層析法，敏感性為89.4%，特異性為94.4%，但待檢樣本中亞洲基因型較少。2018年，Huits等[19]增加亞洲基因型樣本，并使用同對單抗進行免疫層析試驗，發現這對單抗對亞洲基因型CHIKV的檢測敏感性只有33.3%。為進一步了解該方法對不同基因型檢測的差異性，Tuekprakhon等[20]對3種基因型CHIKV的E1氨基酸序列比對，發現配對單抗來源的ECSA型CHIKV在350位點處為谷氨酸，而亞洲型和西非型為天冬氨酸。并通過定點突變證實了該表位的突變是導致單抗結合能力下降的主要原因。為進一步提高檢測方法的敏感性及對不同基因型的檢測差異性，Tuekprakhon等[21]重新以ECSA型和亞洲型CHIKV免疫小鼠制備獲得一批能夠同時檢測到3個基因型的CHIKV特異性單抗，且其中兩株抗E1單抗與DENV、ZIKV、辛德畢斯病毒、ONNV、羅斯河病毒、Mayaro病毒、西部、東部及委內瑞拉馬腦炎病毒均無交叉反應，有望發展出一種特異性的CHIKV抗原檢測試劑盒。

4 分子生物學檢測

4.1RT-PCR 近年來, 隨著分子生物學診斷方法的日益完善,各種RT-PCR方案已嘗試于病毒感染早期、抗體尚未出現時的檢測，其一般針對非結構蛋白nsP1基因[22-23]及包膜糖蛋白基因[24-25]。CHIKV的RT-PCR通常應用于發病2～6 d的血漿或血清標本。最近發現全血也可作為標本檢測，且診斷性能與商品化檢測試劑盒基本一致[26]；對于發病1周內難以采集血液標本的患者，可以唾液標本代替檢測[27]；對于哺乳期患者，母乳標本的檢測時限可延長至發病第23 d[28]；精液和尿液檢測時限還可延長至發病第30 d[29]。針對CHIKF與其他蟲媒病毒病共同流行的特點，Cecilia等[30]開發了可用于同時診斷CHIKV和DENV的多重實時RT-PCR，Liu等[22]和Calvo等[24]分別開發了可用于同時診斷CHIKV和ZIKV感染的一步法多重實時定量RT-PCR及同時診斷CHIKV、ZIKV與DENV的一步法多重RT-PCR。Giry等[25]針對DENV、鉤體病等在留尼汪島的交叉流行特點，開發了能同時區分CHIKV、DENV和鉤端螺旋體感染的一步法多重實時RT-PCR。最近，Wu等[31]開發了可用于同時診斷CHIKV、DENV、ZIKV和YFV的單管四重實時RT-PCR，該方法對CHIKV的檢測下限為11拷貝/反應，與乙腦、乙肝、丙肝、腸道病毒71型、巨細胞病毒均無交叉，且與商品化試劑檢測結果相一致。Boga等[32]還開發了可用于同時診斷CHIKV、DENV、ZIKV、YFV和WNV的多重實時RT-PCR，該檢測體系的準確率為94.4%，與蜱傳腦炎病毒和日本腦炎病毒均無交叉，這些多重RT-PCR試劑可用于疫區旅行者的感染篩查及常見蟲媒病毒的流行病學監測。

4.2RT-LAMP 這是一種逆轉錄環介導的等溫擴增技術，無需特殊儀器設備，只需水浴鍋或金屬浴，適合于基層醫療單位及出入境口岸等機構使用。然而，早期的RT-LAMP試劑是2007年到2012年開發的，引物設計所能利用的信息有限。2018年，Lopez-Jimena等[33]利用NCBI數據庫中的110條CHIKV序列，通過LAVA軟件重新設計了靶向保守區域6K-E1的引物，開發了單管一步法實時RT-LAMP，力求涵蓋所有可能流行的CHIKV毒株，該法陽性預測值為97%，陰性預測值為100%，在標本儲存條件不佳的情況下仍表現出較好的診斷性能。

4.3宏基因組測序 宏基因組測序是目前唯一能識別臨床樣品中所有潛在病原體的序列信息的診斷方法。2015年，Greninger等[34]首次將宏基因組納米孔測序與實時生物信息學分析應用于CHIKF診斷，6 h內即可完成檢測，但平均納米孔讀取錯誤率高達20.6%，與樣本間交叉污染有關。2016年，Sardi等[35]將宏基因組測序應用于診斷CHIKV與ZIKV的共同感染。2018年，Kafetzopoulou等[36]成功將宏基因組測序應用于CHIKV與DENV共同感染的鑒定。進一步縮短文庫構建時間、降低檢測閾值、優化生物信息學工具、控制交叉污染與降低成本之后，有望將宏基因組測序應用于基層醫療點的急性發熱性疾病的鑒別診斷與共同感染的鑒定。

綜上所述，鑒于CHIKV與其他蟲媒病毒感染存在相似的臨床癥狀，不同病毒感染的臨床治療方式存在差異。因此，方便、快捷的CHIKV實驗室診斷方法將有利于CHIKF的臨床診治。由于流行疫區往往存在幾種蟲媒病毒交替流行的特點，患者也可出現幾種病毒同時感染的可能。因此，近3年CHIKV在實驗室診斷方面主要致力于：制備特異性單克隆抗體建立ELISA法檢測IgM 和(或)IgG、針對保守區域開發敏感性高且涵蓋3種基因型CHIKV的抗原檢測試劑、開發可用于同時診斷CHIKV與其他蟲媒病毒感染的多重RT-PCR方法，以及簡化診斷方法與降低成本以促進CHIKV診斷試劑在基層的推廣。盡管目前針對CHIKV開發的實驗室診斷方法已經不少，但真正獲得生產許可的商品化診斷試劑為數不多，相對于昂貴的核酸檢測試劑，基于ELISA和膠體金免疫層析的IgM/IgG抗體和抗原檢測方法將是更好的選擇。

利益沖突：無

引用本文格式：徐佩佩，丁細霞.基孔肯雅病毒實驗診斷進展[J].中國人獸共患病學報，2020，36(1):60-64. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.188