牛乳腺炎無乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼BP亞基單克隆抗體膠體金標記試紙條制備

布日額，吳金花, 錫林高娃，陳金龍,王金良

奶牛隱性乳腺炎(sub-clinical mastitis of dairy cattle)是奶牛養殖過程中的一種高發病，在內蒙古地區奶牛隱性乳腺炎的發病率在50%以上，患牛臨床癥狀不易察覺，所產乳汁與健康奶牛所產奶沒有較大的區別，在飼養管理不當、環境急劇變化等條件下極易轉變為臨床型乳腺炎[1-2]。無乳鏈球菌是引起奶牛隱型乳房炎的重要病原菌之一，屬B群鏈球菌(Group BStreptococcusagalactea，GBS)，患病奶牛生產的乳由于質量差，營養成分遭到破壞，混有人畜共患無乳鏈球菌，故極易對人類造成感染性危害，特別是對機體免疫力低下的老人及嬰幼兒其危害更為嚴重[3-4]。近年來，隨著我國人均牛奶消費量的增加，奶牛養殖業的迅速發展和奶牛養殖密度的加大，再加上飼養福利條件相對較差,養殖環境衛生與消毒工作難以規范化實施，奶牛隱性乳腺炎的發病率有逐年上升趨勢，每年因奶牛隱性乳腺炎所帶來的直接或者間接經濟損失巨大。

迄今為止，無乳鏈球菌的檢測常用方法側重于傳統的細菌學分離鑒定，如常規PCR鑒定等，這些方法均存在程度不等的缺陷和不足。傳統無乳鏈球菌的分離、培養、鑒定、檢測方法耗時，儀器依賴性強，無法滿足臨床對乳腺炎乳樣的快速檢測[5-7]。膠體金免疫層析技術實施方便、快速，便于基層使用和現場推廣使用，更加適合臨床無乳鏈球菌乳樣的快速檢測[8-10]。在該檢測技術產品的制備過程中，單克隆抗體的高靈敏度，強特異性使得免疫膠體金層析技術在快速鑒定病原體，以及準確的診斷方面發揮了關鍵作用。因此，制備無乳鏈球菌相關診斷亞單位抗原的單克隆抗體，具有良好的應用價值和市場前景。無乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼BP亞基基因編碼類似大腸桿菌的菌毛樣結構菌毛骨架蛋白部分，具有良好的抗原性，研究表明，該蛋白抗原可以作為無乳鏈球菌抗體的診斷抗原。本課題組在前期研究中，將BP抗原包被ELISA平板，用于臨床無乳鏈球菌隱性乳腺炎的篩查，國外也有類似研究報道[11-12]。本研究在前期研究的基礎上，將奶牛無乳鏈球菌的BP基因進行表達、純化，制備單克隆抗體，經膠體金標記后制備了快速檢測牛乳源性無乳鏈球菌的膠體金標記檢測試紙條[13]。

1 材料與方法

1.1菌株、載體及實驗動物 大腸桿菌BL21即用型感受態細胞購自北京索萊寶科技有限公司；SP2/0骨髓瘤細胞、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、化膿性鏈球菌等菌種、pET30a(+)-BP重組質粒由本實驗室保存；Babl/c小鼠購自濟南市金豐實驗動物有限公司。

1.2主要試劑、器材 無乳鏈球菌山羊多克隆抗體為本實驗制備并純化保存，硫酸卡那霉素、IPTG、HIS標簽蛋白親和層析填料購自北京索萊寶科技有限公司；單抗亞類鑒定ELISA試劑盒購自上海士峰生物科技有限公司。低分子量蛋白Marker、HAT、PEG1500、胎牛血清等為Thermo公司產品。

1.4重組基因工程菌的誘導表達、純化 將pET30a(+)-BP重組質粒克隆轉化至BL21大腸桿菌感受態細胞中，經誘導表達后超聲破碎，將表達產物進行SDS-PAGE分析，純化及蛋白含量測定。

1.5抗BP重組抗原單克隆抗體的制備

1.5.1小鼠免疫 選擇4只SPF級balb/c小鼠免疫，首免用純化的BP蛋白50 μg與等量的弗氏完全佐劑乳化后皮下注射，然后每間隔14 d進行一次加強免疫，共免疫3次，每次每只50 μg抗原與等量的弗氏不完全佐劑乳化混勻。3次加強免疫后，檢測小鼠血清效價，當效價達到1∶10 000時，用100 μg抗原沖擊免疫，3 d后進行細胞融合與篩選。

1.5.2細胞融合與篩選 無菌采集小鼠脾細胞，加入少量HAT備用。收集培養好的骨髓瘤細胞洗滌3次，將脾細胞與骨髓瘤細胞按一定比例混合后，于37 ℃水浴1 min內緩慢加入1 mL的PEG，靜置1 min。加入準備好的飼養細胞于37℃，5% CO2的孵化箱中培養7 d，待細胞長滿孔底時用間接ELISA 方法進行篩選，檢測為陽性的雜交瘤細胞擴大培養并凍存備用，將滅活的無乳鏈球菌(108CFU/孔)包被戊二醛預處理過的ELISA平板，對篩選出的陽性細胞株培養上清進行檢測。

1.5.3單克隆抗體的制備與純化 首先向小鼠腹腔注入弗氏佐劑致敏，7 d后每只小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水。收集腹水并離心去除腹水中的細胞和油脂，用硫酸銨沉淀法及親和層析提取腹水中的IgG抗體，測得純化抗體的濃度。

1.6單克隆抗體的鑒定

1.6.1克隆抗體效價及雜交瘤細胞株的穩定性 將細胞株連續傳代15次，分別取細胞上清用間接ELISA方法檢測抗體效價并比較其穩定性。

1.6.2抗體亞型鑒定 按照單抗亞類鑒定ELISA試劑盒說明書進行。

納入和排除標準[2] ：①所有患者神經功能損害體征持續時間超過1 h，NIHSS評分≥4分，顱腦CT檢查發現患者雙側基底節區多發性腔隙性腦梗死；②排除3個月內有卒中史和重大顱腦外傷史、可疑蛛網膜下腔出血、顱內出血既往史、顱內腫瘤、及型出血傾向、活動性內出血、血壓異常升高（收縮壓超過180 mmHg或舒張壓超過100 mmHg）、不符合溶栓治療適應征的患者。

1.7單克隆抗體的膠體金標記 使用4H5抗體標記金顆粒，抗體標記量為6μg/mL，標記pH值8.0，膠體金封閉液為10% BSA，無乳鏈球菌山羊多抗包被檢測線，檢測線噴涂抗體含量為1 mg/mL，質控線噴涂含量為1.5 mg/mL的羊抗鼠二抗，具體標記方法是利用杭州峰航科技有限公司的噴金標機和連續劃膜機進行。

1.8金標試紙條靈敏度及特異性測試 將人工培養的乳腺炎無乳鏈球菌進行菌落計數，并梯度稀釋至103～109CFU/mL，用制備的膠體金標記檢測試紙條進行靈敏度測試。利用制備的膠體金檢測試紙條分別對人工培養的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、化膿性鏈球菌含量均調整至108CFU/mL進行檢測，測試其特異性。

2 結 果

2.1重組基因工程菌的誘導表達及蛋白純化 重組 pET30a(+)-BP質粒轉化至BL21(DE3)感受態細胞，經終濃度為1 mmol 的IPTG誘導表達5 h后，經SDS-PAGE電泳顯示，在約32 ku處出現清晰的目的條帶。可溶性鑒定顯示，目的蛋白主要存在于沉淀中，沉淀經變性、復性及His標簽填料親和層析純化后，BCA法測定蛋白濃度為1.2 mg/mL(見圖1)。

M為蛋白Marker；1為pET30a(+)-BP誘導后；2為誘導后上清；3為破碎沉淀； 4為純化蛋白BP圖1 BP重組蛋白表達及純化SDS-PAGE鑒定Fig.1 Identification of recombinant protein expression and purification of BP by SDS-PAGE

2.2BP重組抗原單克隆抗體的制備 Balb/c小鼠經4次免疫后，ELISA檢測小鼠血清抗體效達到1∶51 200(見圖2)，融合細胞經多次亞克隆及篩選，再經玻片凝集試驗對抗體進行二次篩選，獲得1株穩定的抗BP重組抗原的單克隆抗體，將其命名為4H5。純化后的單抗，經Bradford法測定，結果顯示單抗含量為4.3 mg/mL(見圖3)。

圖2 4次免疫后小鼠血清效價Fig.2 Serum titers of mice serum after 4 times immunizations

M為蛋白Marker；1、2為純化后的單抗4H5圖3 單抗純化后SDS-PAGE鑒定Fig.3 Identification of purified McAb by SDS-PAGE

2.3單克隆抗體的鑒定

2.3.1單抗腹水效價及雜交瘤細胞株的穩定性 經間接ELISA檢測，4H5株單抗腹水的效價為1∶25 600。在細胞連續培養過程中，當連續傳至15代時，其培養上清效價仍然穩定。

2.3.2單抗亞型鑒定 單抗亞型鑒定結果表明，該株單抗均屬于IgG1亞類。

2.4膠體金試紙條靈敏度 靈敏度測試結果表明，制備的膠體金檢測卡最低可以檢測106CFU/mL的無乳鏈球菌(見圖4)。

2.5膠體金試紙特異性 特異性測試結果表明，制備的膠體金檢測卡與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、副結核桿菌、化膿性鏈球菌培養物人工污染牛乳均無反應，與無乳鏈球菌培養物人工污染牛乳樣出現陽性反應(見圖5)。

1為109 CFU/mL；2為108 CFU/mL；3為107 CFU/mL；4為106 CFU/mL；5為105 CFU/mL；6為104 CFU/mL；7為103 CFU/mL圖4 膠體金試紙條靈敏度測試Fig.4 Sensitivity test of colloidal gold labeled strip

1為無乳鏈球菌；2為金黃色葡萄球菌；3為大腸桿菌；4為沙門氏菌；5為化膿性鏈球菌；6為副結核桿菌圖5 膠體金標記試紙條特異性測試Fig.5 Specificity test of colloidal gold labeled strip

3 討 論

無乳鏈球菌具有類似大腸桿菌的菌毛樣結構，屬于菌體表面附屬物，能夠促進細菌對宿主細胞的粘附和定植，并介導無乳鏈球菌對抗菌肽AMPs的抗性。相關研究表明，BP基因編碼無乳鏈球菌菌毛結構中的骨架亞基部分，具有良好的免疫保護性[14-15]。國內已有學者曾嘗試針對無乳鏈球菌致病因子制備單克隆抗體或者多克隆抗體，并應用于無乳鏈球菌的快速檢測。張新艷等[16]成功制備了針對羅非魚無乳鏈球菌的SIP蛋白的兩株單克隆抗體，成功建立了針對羅非魚無乳鏈球菌的雙抗體夾心法ELISA檢測方法，該檢測方法的實際應用結果與PCR方法的符合率達到 98.33%。華亞南[17]于2016年制備了抗無乳鏈球菌多克隆抗體,建立了檢測無乳鏈球菌的間接競爭ELISA法，并用此方法明確了羅非魚感染鏈球菌數量與發病風險的關系。但是尚未見到針對奶牛乳腺炎無乳鏈球菌菌毛亞單位BP制備單克隆抗體，并制備膠體金快速檢測試劑盒的研究報道。本課題組在前期研究中曾制備了針對牛乳腺炎Ia型菌株PI-2a菌毛島嶼3個亞基AP1-AP2-BP融合抗原的單克隆抗體，經膠體金標記制備檢測試紙條，對無乳鏈球菌加檢測后，結果顯示效果不佳。所以，經進一步篩選，顯示BP亞基抗原制備的單克隆抗體的檢測效果良好，特異性及靈敏度均達到檢測的要求。該研究屬于首次開展針對無乳鏈球菌PI-2a菌毛亞單位BP制備單克隆抗體，并制備快速檢測牛乳腺炎無乳鏈球菌的膠體金標記免疫層析試劑盒的研究。

本研究中共篩選出與無乳鏈球菌菌毛BP亞基蛋白有較好反應的38株雜交瘤細胞株，將無乳鏈球菌(108CFU)滅活后，包被戊二醛預處理的ELISA板，對篩選出的陽性細胞株培養上清進行二次篩選，最終篩選出1株與無乳鏈球菌特異性反應的雜交瘤細胞株，命名為4H5。該株單抗細胞經連續傳代培養15代，其培養上清中單抗的效價依然穩定，最終制備的腹水抗體效價達到1∶256 00。利用膠體金標記該單抗，用無乳鏈球菌山羊多克隆抗體作為檢測線，最終制備的膠體金檢測卡最低可以檢測106CFU/mL的無乳鏈球菌，制備的膠體金檢測卡與人工培養的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、副結核桿菌等均沒有交叉反應，這均表明制備的膠體金卡具有較好的特異性與敏感性。該研究成果為無乳鏈球菌性乳腺炎的快速檢測及流行病學調查將提供有效的技術支持。

利益沖突：無。

引用本文格式：布日額，吳金花，錫林高娃,等. 牛乳腺炎無乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼BP亞基單克隆抗體膠體金標記試紙條制備[J].中國人獸共患病學報，2020，36(1):45-49. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.186