胡麻株高QTL定位與候選基因功能分析

宋夏夏, 王利民, 張建平, 張天豹, 劉彩月, 龍艷*, 裴新梧

(1.中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081; 2.甘肅省農業科學院作物研究所, 蘭州 730070)

亞麻(LinumusitatissimumL.)屬于亞麻科亞麻屬，為一年生草本植物。亞麻一般可以分為纖維亞麻、油用亞麻和兼用亞麻。胡麻為油用亞麻，是我國華北和西北地區重要的油料作物和經濟作物。隨著人們生活水平的提高，綠色健康的食用油越來越受歡迎。胡麻是α-亞麻酸含量較高的油料作物之一，其籽油中α-亞麻酸的含量約占總脂肪酸的50%，使得胡麻籽油在食品、飼料和工業應用中具有重要價值[1-2]。α-亞麻酸是人體內長不飽和脂肪酸EPA(eicosapentaenoic acid，二十碳五烯酸)、DPA(docosapentaenoic acid,二十二碳五烯酸)和DHA(docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸)的前體，具有降血脂、預防心血管疾病、抗炎抗癌和改善記憶力等保健功效[3-5]。同時，胡麻籽還含有胡麻膠、木酚素、膳食纖維等對人體有益的物質[6]，在食品保健方面具有廣闊的開發前景。株高不僅影響胡麻產量和胡麻籽品質，還與植株倒伏性狀相關，是一個由基因和環境共同作用的復雜數量性狀(quantitative trait loci，QTL)。因此，研究控制胡麻株高的QTL有助于了解胡麻生長的分子基礎和調控機理，為胡麻品種的性狀改良和產量提高奠定基礎。快速發展的高通量測序技術和有效的植物基因組參考序列為高分辨率性狀作圖和快速識別候選基因或診斷標記提供了可能性。

QTL-seq技術充分利用BSA和高通量測序技術，直接將具有差異性狀的基因池混合進行高通量測序，獲得大量豐富的SNP標記，計算每個SNP位點的SNP-index(該位點與參考序列不同的reads數占總reads數的比例)，然后將兩個基因池每個位點的SNP-index相減得到差值ΔSNP-index，從而獲取全基因組范圍內的ΔSNP-index圖譜。由于除目標基因區域外的其他基因組區域理論上沒有差異，即ΔSNP-index接近于0，所以將ΔSNP-index顯著偏離0的位點作為候選位點。QTL-seq策略最先在水稻中提出，利用水稻F2和RIL群體成功定位了水稻中抗病及與幼苗活力相關的QTL[7]。Daware等[8]用QTL-seq結合SSR方法定位了調控水稻粒重的基因，構建了水稻高密度SSR圖譜，包含3 791個標記，總圖距為2 060 cM，標記間平均距離為0.54 cM。通過生物信息學分析，將控制粒重的QTL粗定位在6條染色體上，共解釋31%的表型變異。而后結合QTL-seq和差異基因表達分析，縮小了一個粒重主效QTL的遺傳區間，成功定位了一個粒重主效基因。Shu等[9]研究了花椰菜和甘藍中控制開花時間的QTL。同時，該方法已成功應用于黃瓜早花QTL[10]、西紅柿重量和果實數QTL[11]、鷹嘴豆百粒重和根源特質比相關QTL[12-14]以及木豆抗病性相關QTL[15]。

本研究以加拿大高含油量油用品種Macbeth和中國纖用品種黑亞14號為親本構建的重組自交系(RIL F7)群體為材料，統計了該群體在不同時間不同地區的株高表型，利用QTL-seq方法對胡麻株高QTL進行了定位分析和候選基因預測，并將候選株高基因轉入擬南芥中進行基因功能驗證。本研究不僅初步鑒定了胡麻中控制株高的功能基因，同時探索出利用QTL-seq方法快速有效定位并克隆胡麻數量性狀主效基因的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為Macbeth(母本)、黑亞14號(父本)及得到的RIL F7群體，共155個株系，由甘肅省農業科學院作物研究所提供。試驗材料于2016年種植于中國農業科學院河北廊坊試驗基地，每行種植一個株系30株，行寬1 m，行距20 cm。親本及RIL群體各株系分別設置3個重復種植。種植期間進行常規田間管理，待至成熟期時統計單株株高。

1.2 方法

1.2.1株高統計和分析 在胡麻成熟期，測量和統計地面到植株頂端高度(cm)。每一個RIL株系以3株植株的株高均值作為表型值。結合該群體在甘肅蘭州、甘肅景泰和云南元謀3個不同環境的株高數據(甘肅省農業科學院作物研究所提供)，比較不同環境的各單株的株高表型。選取在四個環境均表現為高、低株的株系各15株分別作為高、低株混池備選單株。

1.2.2胡麻基因組DNA的提取 在苗期取2個親本及RIL群體所有單株的葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測。

1.2.3文庫構建及測序 檢測合格的DNA加滅菌ddH2O稀釋，將濃度統一調整為100 ng·μL-1。將2個池的各15個株系單株DNA等體積混合，獲得高株基因池和低株基因池。采用TruSeq Library Construction Kit構建親本和兩個基因池文庫，通過Illumina HiSeqTM PE 150進行測序。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋至1 ng·μL-1，隨后利用Agilent 2100對文庫的插入大小進行檢測，符合預期后使用QPCR方法[16]對文庫的有效濃度(>2 nmol·L-1)進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格后進行Illumina HiSeq TM PE150測序。

1.2.4生物信息分析 對測序得到的原始數據(raw data)進行質控得到可用數據(clean data)；根據比對結果，進行SNP、InDel的檢測及注釋，從而得到每個樣本的SNP數據，初步確定株高候選基因。

1.2.5株高候選基因植物表達載體構建 根據植物表達載體35s-redkan的多克隆位點AseⅠ和BamHⅠ兩側同源序列，設計帶有載體同源序列的引物(LuCWINV1-Fi:5’-ACGCGTAAGGGG-ATCCGGTGCACAATGGAATTTACCA；LuCWINV1-Ri：5’-CGGGTCTAGAGAATTCGGTTCACCATTCG-GGAGTATC)用于擴增包含載體接頭的LuCWINV-1序列。采用Minibest Plant RNA Extraction試劑盒(TaKaRa)提取親本總RNA，反轉錄得到cDNA后進行擴增。擴增體系：LuCWINV1-Fi/Ri引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，模板2 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL，ddH2O 22 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性10 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 min，35個循環；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。經10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。PCR產物和酶切產物分別經切膠純化后，以35s-redkan植物表達載體，用In-Fusion HD Cloning Kit連接并轉化大腸桿菌，用含有50 mg·L-1Kan的LB平板篩選陽性克隆。

1.2.6擬南芥的遺傳轉化 利用凍融法將構建好的載體轉入農桿菌EH105中，采用蘸花法進行擬南芥的遺傳轉化[17]。構建好的植物表達載體35S-Redkan-LuCWINV1-1Hei和35S-Redkan-LuCWINV1-1Mac具有紅光選擇標記，在綠色光源下，用紅色眼鏡觀察收獲的轉基因種子會發出紅光。在擬南芥培養室中種植轉基因擬南芥陽性株系，觀察T3代純合株系的表型。當擬南芥生長至株高不再增加時，測量其株高。

2 結果與分析

2.1 重組自交系系株高統計和分析

結合甘肅蘭州和景泰及云南元謀的三個地區株高數據，分析不同環境下的RIL群體株高分布情況。結果表明，在4個環境中，黑亞14號株高均比Macbeth高，且在4個環境中的RIL群體株高表型分布均為正態分布(圖1)。選取4個環境中均表現為高株和低株的胡麻株系各15株分別作為高/低單株池，用于胡麻株高QTL定位。

注：實心和空心箭頭分別為父本黑亞14號和母本Macbeth。

2.2 測序結果分析和初步確定株高候選基因

對胡麻RIL群體高、低株混池及父、母本進行重測序，檢測變異位點。結果顯示，測序樣品在胡麻基因組上覆蓋率為84.62%～89.71%，測序平均覆蓋深度為13.15～15.39(表1)。據統計，基因上發生SNP位點突變的總數量為362 347個，其中SNP發生在基因上游的有29 492個，發生在外顯子上的有45 418個，發生在內含子上的有44 616個，發生在可變剪接區的有138個，發生在基因下游的有27 319個，發生在基因間隔區的有209 051個。發生在外顯子上的突變包括導致翻譯提前終止的有348個，導致翻譯延后終止的有98個，同義突變22 602個以及非同義突變22 370個(表2)。

表1 測序深度及覆蓋度

表2 SNP檢測及注釋結果

本研究將QTL-seq方法得到的結果與前期傳統QTL定位結果[18]結合起來分析發現，位于14連鎖群上的主效QTL定位在scaffold 603上，同時在delta-SNP index上分析發現位于scaffold 603上的基因Lus10015614在其上游區(49 861 bp)存在SNP位點，將該基因作為候選基因。

2.3 株高主效基因的克隆分析

從phytozome數據庫中下載得到Lus10015614的基因組和cDNA序列。該基因序列與擬南芥At3g13790(Atwinv1)匹配度非常高(67%)，擬南芥At3g13790為細胞壁轉化酶(cell wall invertase)，將胡麻中lus10015614.g命名為LuCWINV1-1。phytozome數據庫中LuCWINV1-1的基因長度為3 818 bp，編碼區長度為1 749 bp。設計引物在黑亞14(父本)和Macbeth(母本)的LuCWINV1的基因組和cDNA中擴增，得到了和目標大小相同的片段，測序后對序列進行分析。

測序結果顯示，黑亞14號和Macbeth中該基因的長度均為3 818 bp，但是序列不完全一致，兩個親本的氨基酸序列共有2個氨基酸發生改變，導致Macbeth中第21位的谷氨酸和第523位異亮氨酸在黑亞14中分別為甘氨酸和丙氨酸。

2.4 黑亞14號和Macbeth中LuCWINV1-1不同時期內源表達分析

為了研究LuCWINV1-1在胡麻中的表達模式，本研究選取不同時期和不同組織的RIL群體親本胡麻植株進行熒光定量分析。胡麻在第3～7周為快速生長期，第7周處于快速生長期后期。結果顯示，生長2～6周的黑亞14號和Macbeth的葉片和莖中LuCWINV1-1的表達量處于較低水平，同時在這兩個品種之間沒有很大差異。在胡麻快速生長后期(第7周)和成熟期(第8和9周)，LuCWINV1-1的表達量大幅增加。此外，黑亞14號在第9周時與之前相比葉中LuCWINV1-1的表達量顯著增加，但是不如Macbeth的葉片中同一時期的表達量高(圖2)。

圖2 黑亞14號和Macbeth不同組織不同時期LuCWINV1-1表達量

2.5 株高候選基因在擬南芥中的遺傳轉化和功能驗證

將胡麻黑亞14號和Macbeth中的LuCWINV1-1基因通過農桿菌介導的蘸花法遺傳轉化擬南芥，獲得T3代純合轉基因株系，以野生型擬南芥為對照比較株高表型。

統計結果表明，與野生型擬南芥相比，4個LuCWINV1-1Mac轉基因株系(6F-1、6F-2、6F-4和6F-6)的株高表現為極顯著降低；4個LuCWINV1-1Hei轉基因株系(6M-10、6M-11、6M-12和6M-14)的株高表現為極顯著增加，1個LuCWINV1-1Hei轉基因株系(6M-13)表現為顯著增加(圖3，表3)。綜上所述，LuCWINV1-1對胡麻株高的解析具有重要意義，可用于后續研究。

表3 轉基因擬南芥和野生型株高統計

圖3 LuCWINV1-1Hei和LuCWINV1-1Mac轉基因株系表型

3 討論

QTL-seq是植物中快速有效定位QTL的方法之一，隨著高通量測序技術的快速發展和測序價格的降低，近年來已成功應用于多種植物中。胡麻為二倍體作物，基因組相對較小，但目前還沒有QTL-seq方法應用于胡麻QTL研究的相關報道。本研究以胡麻RIL群體(Macbeth×黑亞14號)為材料，利用QTL-seq成功檢測了控制胡麻株高性狀的QTL。在scaffold2096、scaffold2057和scaffold228等10個不同的scaffold上共檢測到10個與株高有關的QTL。本研究根據群體內各株系的株高表型數據構建兩個極端表型的混池，將QTL-seq方法應用于胡麻QTL的定位研究中。由于作物數量性狀易受環境影響，本研究結合多年多點的表型數據進行基因池的構建，排除了環境的干擾，提高了QTL定位的精度。在利用測序QTL-seq尋找差異SNP位點時，測序數據的深度及基因組覆蓋度為能否找到合適SNP位點的關鍵因素。平均測序深度達到10×以上，能有效找到合適的SNP位點。因此，在不同作物利用QTL-seq方法進行SNP關聯位點分析時要根據基因組倍性、大小等因素來設計合適的測序倍數來進行。本研究結果表明,QTL-seq應用于胡麻QTL定位研究的可行性，為以后快速定位控制胡麻重要性狀的基因提供了基礎。

通過與擬南芥、水稻基因組序列進行比較發現，本研究定位的LuCWINV1-1屬于酸性轉化酶中的細胞壁轉化酶，包含細胞壁轉化酶基因保守的結構域NDPNG、RDP和MWECP。胡麻RIL群體親本黑亞14號和Macbeth中的LuCWINV1-1氨基酸序列不同，這預示著等位基因功能的變化可能是由于氨基酸的改變造成的。擬南芥轉基因植株株高表型也初步證明了這一推斷，來自于Macbeth的等位基因導入后植株株高明顯低于由黑亞14號的等位基因導入后植株的株高。在擬南芥中也發現，轉化酶家族與植株生長發育有關，轉化酶的缺失會導致擬南芥生長發育速度減慢，根長變短，植株變矮，發芽和開花受到影響，植株生物量減少[19-23]，本研究所鑒定的胡麻LuCWINV1-1基因具有潛在研究價值。