腸桿菌對蓼科植物鎘砷污染土壤修復機理研究

李 藝，王炳森，黃媛媛，姚亞威，林嘉敏，劉可慧，于方明*

2014年《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，全國土壤環境狀況不容樂觀。其中，鎘污染點位超標率為7.0%，砷污染點位超標率為2.7%，在無機污染物中位列第一和第三[1]。因此，對于土壤鎘-砷污染的修復至關重要。植物-微生物聯合修復是近年來土壤修復的研究熱點。有研究表明，一些根際微生物對植物的生長具有顯著的促進作用[2]，被稱作“根際促生菌”。另外，部分耐重金屬的微生物還能顯著提高植物對重金屬的富集能力[3-4]。Nie等[5]的研究表明，植物促生菌Enterobacter cloacae CAL2通過分泌氨基環丙烷羧酸脫氫酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC），有效促進了歐洲油菜（Brassica napus L.）對砷的富集。趙根成等[6]的研究也表明，接種放線菌PSQ、sh2和細菌TS37、C13顯著提高了蜈蚣草（Pteris vittata L.）對砷的富集。

研究表明，在植物受到外界脅迫時如重金屬脅迫，植物體內的抗氧化酶及非酶抗氧化劑可以清除植物體內過多的活性氧物質，以減輕逆境脅迫對植物的損傷，是植物抵抗逆境脅迫的重要防御機制[7]。根際微生物可通過提高植物對非生物逆境脅迫的忍耐能力從而促進植物在逆境脅迫下的生長。湯葉濤等[8]研究發現，高濃度鎘脅迫導致滇苦菜（Picrisdivaricata）體內H2O2和丙二醛（MDA）含量以及陰離子超氧自由基產生速率顯著提高。李燕等[9]研究表明，重金屬錳對短毛蓼（Polygonum pubescens Blume）的脅迫引起了植物體內H2O2和MDA的累積，同時超氧化物歧化酶（SOD）活性隨著外界重金屬濃度的升高而升高。張子楊等[10]的研究表明，接種Streptomyces pactum Act1對包心芥菜（Brassica juncea）的抗氧化酶系統有積極作用，可以有效降低MDA的含量，提高植物對鎘的富集能力。Pandey等[11]的研究表明鎘耐受菌Ochrobactrum sp.和砷耐受菌Bacillus sp.的接種可以有效提高水稻（Oryza sativa L.）根部的SOD含量，并且可以通過分泌ACC促進水稻的生長，提高其對鎘和砷的富集能力。

水蓼（Polygonum hydropiper L.）[12]和 酸 模 葉 蓼（Polygonum lapathifolium L.）[13]作為兩種常見的蓼科植物，具有較好的錳富集和耐受能力。腸桿菌FM-1（Enterobacter sp.FM-1）為新發現的對鎘具有一定耐性且對植物有一定促進作用的微生物[14]，但水蓼和酸模葉蓼對于鎘和砷的富集性能，以及腸桿菌對其的促生特性尚未有研究報道。因此，本研究通過灌根的方式，研究了腸桿菌對水蓼和酸模葉蓼生長、鎘和砷富集以及植物抗氧化酶系統和非酶系統的影響，旨在為鎘-砷復合污染土壤的植物-微生物聯合修復提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鎘耐受菌——腸桿菌FM-1，GenBank登錄號：MF664375；中國典型培養物保藏中心保藏號：2017825[14]。水蓼和酸模葉蓼采自廣西桂林漓江沿岸。

鎘-砷復合污染土壤采自廣西桂林陽朔思的村。土壤采集時先去除地表雜物，然后采用蛇形5點法采集0～20 cm的土壤，混合均勻后，置于塑料袋中運回實驗室。土壤經自然風干后，一部分過4 mm篩，另一部分過0.149 mm的尼龍篩備用。土壤的理化性質采用魯如坤的《土壤農業化學分析法》[15]進行測定，結果見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物栽培

將過4 mm孔徑篩的土壤裝入直徑為25 cm的黑色塑料盆，每盆2.5 kg；并加入基肥，基肥標準：N 100 mg·kg-1（以干土計，下同），以NH4NO3形式加入；P和K分別為80 mg·kg-1和100 mg·kg-1，以KH2PO4形式加入，每30 d施加追肥一次。水蓼和酸模葉蓼采用扦插的方式進行栽培，選取長勢良好且粗細一致的莖，用自來水沖洗2～3次，洗掉泥土，用剪刀剪成長度約為5 cm的莖段，保留一個完整的節間和一個腋芽。將剪短的植物莖段插入裝好土壤的盆中，保留腋芽于土壤上面。每盆扦插4株，定期澆水，保持在田間最大持水量的60%。

表1 土壤理化性質Table 1 Physical and chemical character of soil

1.2.2 微生物接種

在植物長出新芽且培養15 d后，以灌根的方式分別接種OD600值為0.25、0.5和1.0的菌懸液（其對應的濃度分別為 5.5×108、1.0×109、2.8×109CFU·mL-1）30 mL于未滅菌的土壤中，每7 d接種一次（在前期的試驗中以7 d為間隔向土壤中接種菌懸液1次），保證土壤中的腸桿菌濃度維持在6.6×106、1.2×107、3.4×107CFU·g-1土左右。以不加腸桿菌為對照。

1.2.3 植物收獲及重金屬含量分析

待植物培養60 d后，取出植物樣品，首先用自來水沖凈，再浸入20 mmol·L-1的EDTA-Na2溶液中交換20 min，以除去附著的重金屬，最后用去離子水洗凈，用吸水紙將水分吸干，用天平稱量生物量。采集同一位置的葉片置于-20℃冰箱用于抗氧化酶和非酶物質的測定，其他部分分為植物根、莖和葉，并分開裝入信封，在105℃烘箱中殺青30 min，且在70℃下烘干48 h至恒質量。烘干的植物樣品用不銹鋼粉碎機磨碎，用于分析重金屬含量。同時測定根際土壤的pH值[16]、有效態砷含量[17]以及水提態鎘含量[18]。

1.2.4 葉綠素、類胡蘿卜素、O-2·、H2O2和丙二醛（MDA）含量的分析

水蓼和酸模葉蓼葉片中葉綠素、類胡蘿卜素、H2O2和O-2·的分析參考Li等[19]的方法，MDA的分析采用Quan等[20]的方法。

1.2.5 抗氧化酶活性的測定

準確稱取0.20 g去葉脈剪碎的葉片于預冷研缽中，加1 mL預冷的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液在冰浴上研磨成勻漿，加緩沖液至體積為8 mL。在4℃條件下10 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗提液，用于超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的測定。其中SOD、CAT和POD的分析參考Parida等[21]和 Wu等[22]的方法。

1.2.6 巰基、谷胱甘肽和植物螯合肽含量分析

巰基（-SH）、谷胱甘肽（GSH）和植物螯合肽（PCs）含量的分析采用El-Zohri等[23]的方法。

1.3 數據處理

實驗數據均以3次重復的平均數±標準誤差表示。方差分析采用SPSS19.0軟件完成，繪圖采用Excel 2010軟件完成。

2 結果與分析

2.1 接種腸桿菌對根際土壤pH、砷的有效態以及鎘的水提態含量的影響

接種腸桿菌（≥1.2×107CFU·g-1土）顯著降低了水蓼和酸模葉蓼根際土壤pH，提高了砷的有效態以及鎘的水提態含量。當接種濃度為3.4×107CFU·g-1土時，水蓼和酸模葉蓼根際土壤pH較對照下降了0.35個和0.28個單位（圖1A）；水蓼根際土壤鎘的水提態和砷的有效態含量分別為1.45 mg·kg-1和1.64 mg·kg-1，較對照分別增加了30%和21%；酸模葉蓼根際土壤鎘的水提態和砷的有效態含量分別為1.35 mg·kg-1和1.59 mg·kg-1，較對照分別增加了29%和17%（圖1B）。

2.2 接種腸桿菌對植物生物量和重金屬富集量的影響

接種腸桿菌對蓼科植物的株高、株質量有不同程度的影響。當接種濃度小于3.4×107CFU·g-1土時，水蓼的株高、株質量與對照間無顯著差異（P＞0.05）。酸模葉蓼的株高隨接種濃度的增加而顯著提高（P＜0.05）；當接種濃度為6.6×106CFU·g-1土時，酸模葉蓼的株質量與對照無差異（P＞0.05）。當濃度為3.4×107CFU·g-1土時，水蓼和酸模葉蓼的株高和株質量顯著增加（P＜0.05），此時，水蓼的株高和株質量分別為對照的1.54倍和1.45倍。酸模葉蓼的株高和株質量分別為對照的2.27倍和1.33倍（圖2）。

另外，隨著腸桿菌接種濃度的增加，水蓼和酸模葉蓼根莖葉中鎘、砷含量呈增加的趨勢。當接種濃度為3.4×107CFU·g-1土時，除酸模葉蓼根中鎘含量外，水蓼和酸模葉蓼根莖葉中的鎘、砷含量顯著高于對照（P＜0.05）。此時，水蓼根中的鎘和砷含量最高，分別達到了81.2 mg·kg-1DW和33.9 mg·kg-1DW，分別為對照的1.64倍和1.68倍（圖3A）。水蓼莖中的鎘和砷含量分別為對照的1.68倍和1.74倍；酸模葉蓼莖中的鎘和砷含量分別為對照的2.51倍和1.21倍（圖3B）。水蓼葉中的鎘和砷含量分別為對照的2.74倍和1.92倍；酸模葉蓼葉中的鎘和砷含量分別為對照的2.12倍和1.86倍（圖3C）。

圖1 接種腸桿菌對水蓼和酸模葉蓼根際土壤pH、砷的有效態以及鎘的水提態含量的影響Figure 1 Effect of Enterobacter sp.addition on the pH and bioavailable concentration of arsenic and water-soluble concentration of cadmiun in rhizosphere soil of Polygonum hydropiper L.and Polygonum lapathifolium L.

圖2 接種腸桿菌對植物株高和株質量的影響Figure 2 Effect of Enterobacter sp.addition on the height and weight of plant

2.3 接種腸桿菌對植物葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

從表2中可以看出，接種腸桿菌（≥1.2×107CFU·g-1土）顯著提高了水蓼和酸模葉蓼葉片中的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量以及水蓼葉片中的總葉綠素含量（P＜0.05）。其中，接種濃度為3.4×107CFU·g-1土時，水蓼和酸模葉蓼葉片中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素含量分別為對照的1.46、2.14、1.61、3.32倍和2.73、2.98、2.04、1.47倍。另外，接種濃度為3.4×107CFU·g-1土時顯著降低了水蓼和酸模葉蓼葉片中葉綠素a/葉綠素b的值（P＜0.05），與對照相比分別降低了31.5%和40.5%。

2.4 接種腸桿菌對植物O-2·、H 2O2、MAD含量及抗氧化酶活性的影響

從表3中可以看出，接種腸桿菌（≥1.2×107CFU·g-1土）顯著降低了水蓼和酸模葉蓼葉片中O2-·、H2O2和MAD的含量（P＜0.05）。當接種濃度為 3.4×107CFU·g-1土時，水蓼和酸模葉蓼葉片中O-2·、H2O2、MAD的含量分別比對照降低了16.9%、74.9%、28.8%和19.5%、59.3%、19.6%。從表3中可以看出，接種濃度≥1.2×107CFU·g-1土時顯著提高了水蓼葉片中SOD、POD、CAT的活性（P＜0.05），分別為對照的 1.65、12.81、2.19倍；當接種濃度為3.4×107CFU·g-1土時顯著提高了酸模葉蓼葉片中POD和CAT的活性，此時分別為對照的2.09倍和3.36倍。但接種腸桿菌對酸模葉蓼葉片中的SOD活性未產生顯著影響（P＞0.05）。

2.5 接種腸桿菌對植物-SH、PCs和GSH含量的影響

當接種腸桿菌濃度≥1.2×107CFU·g-1土時，水蓼和酸模葉蓼葉片中-SH、PCs和GSH的含量顯著增加（P＜0.05）。當接種濃度為3.4×107CFU·g-1土時，水蓼和酸模葉蓼葉片中-SH、PCs、GSH的含量分別比對照增加了92%、97%、104%（圖4A）和111%、124%、96%（圖4B）。

圖3 接種腸桿菌對水蓼和酸模葉蓼根莖葉中砷、鎘含量的影響Figure 3 Arsenic and cadmium content in roots，stems and leaves of Polygonum hydropiper L.and Polygonum lapathifolium L.under different bacterial-inoculated level

2.6 相關性分析

從表4可以看出，根際土壤pH、土壤鎘水提態含量和砷有效態含量與接菌量呈極顯著相關關系（P＜0.001），而植物種類僅對根際土壤pH和鎘水提態含量的變化產生顯著影響（P＜0.05）。接菌量與植物的交互作用對根際土壤pH和砷有效態含量以及鎘水提態含量均沒有顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

本研究發現，當腸桿菌FM-1接種濃度為3.4×107CFU·g-1土時，水蓼和酸模葉蓼的株高和株質量顯著增加（P＜0.05）（圖2），這表明腸桿菌有利于植物的生長，是一種良好的植物促生菌。有研究表明，植物根際促生菌可直接或間接地促進宿主植物的生長[20]，其促生機制主要包括：分泌植物生長素，如吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、氨基環丙烷羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脫氫酶、鐵載體（Siderophore）等促生物質[22]；分泌有機酸和釋放礦質中難溶的營養元素促進植物生長[21]；通過固氮作用促進植物生長；提高植物的抗逆性等[23]。另外，接種腸桿菌FM-1顯著提高了水蓼和酸模葉蓼的葉綠素及類胡蘿卜素含量（表2），葉綠素含量的增加有利于植物的光合作用，從而促進植物生長。這與Guo等[24]通過在鎘污染土壤中接種植物促生菌Bradyrhizobium sp.YL-6，從而通過菌株分泌鐵載體和吲哚乙酸，有效促進黑麥（Lolium multiflorum Lam.）和大豆（Glycinemax L.）生長的研究結論相似。在我們的前期研究中發現腸桿菌FM-1可以通過分泌吲哚乙酸、鐵載體及其具有良好的溶磷性，來促進積雪草對土壤中鎘的富集[25]。

本研究結果表明，接種腸桿菌FM-1降低了水蓼和酸模葉蓼根際土壤的pH（圖1），促進了水蓼和酸模葉蓼根莖葉對鎘和砷的富集（圖3），這可能與土壤中能被植物直接利用的鎘、砷濃度有關。大量的研究結果表明，土壤pH的降低有利于土壤水提態鎘的增加，從而增加植物可利用鎘含量，增加植物對鎘的吸收。Rajkumar等[26]發現植物促生菌Pseudomonas sp.PsM6和Pseudomonasjessenii PjM15通過分泌鐵載體來提高土壤中重金屬的生物可利用性，從而提高蓖麻（Ricinuscommunis）對重金屬的富集。Prapagdee等[27]發現植物促生菌Micrococcus sp.MU1和Klebsiella sp.BAM1通過分泌大量的吲哚乙酸來增加重金屬的生物可利用性，從而提高向日葵（Helianthusannuus）對鎘的富集。

土壤pH的降低一般不利于砷的溶解，但本實驗中腸桿菌的添加降低了水蓼和酸模葉蓼根際土壤的pH（圖1），而植物的砷含量卻增加，這可能與微生物對土壤砷的作用有關。耐砷菌株Pseudomonas2-23T的添加明顯提高了砷沉積物中砷的釋放能力[25]。抗砷菌株E、G可以增強蜈蚣草對砷的吸收能力[28]。另外，這還可能與土壤砷的價態有關。通常在pH＜7時，隨著土壤pH的升高，As（Ⅲ）的吸附量逐漸增加，As（Ⅴ）的吸附量逐漸降低[29]。對于添加腸桿菌所引起的蓼科植物砷吸收量的增加，究竟是腸桿菌促進了土壤砷的溶解還是改變了砷的價態，還有待進一步研究。由此可見，在鎘-砷復合污染土壤中接種腸桿菌FM-1，不僅有效地促進了水蓼和酸模葉蓼的生長，而且提高了水蓼和酸模葉蓼對鎘和砷的富集，是一種良好的植物促生菌。

表2 接種腸桿菌對植物葉片中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、葉綠素a/葉綠素b和類胡蘿卜素含量的影響Table 2 Effects of Enterobacter sp.addition on the content of chlorophyll a，chlorophyll b，total chlorophyll，chlorophyll a/chlorophyll b and carotenoids in the leaves of Polygonum hydropiper L.and Polygonum lapathifolium L.

表3 接種腸桿菌對水蓼和酸模葉蓼葉片中MDA、O-2·、H2O2含量及抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of Enterobacter sp.addition on the content of MDA，O-2·，H2O2 and antioxidant enzyme activity in the leaves of Polygonumhydropiper L.and Polygonumlapathifolium L.

圖4 接種腸桿菌對水蓼和酸模葉蓼葉片中-SH、PCs、GSH含量的影響Figure 4 Effect of Enterobacter sp.addition on the content of-SH，PCs and GSH in the leaves of Polygonum hydropiper L.and Polygonum lapathifolium L.

表4 二元方差分析（F-值和P-值）考察植物種類、接菌量及其交互作用對指標的影響Table 4 F-values and P-value of a Two-way ANOVA of measured parameters of Polygonum hydropiper L.and Polygonum lapathifolium L.，treated with different inoculation level

當植物受到重金屬脅迫時，會超量產生超氧自由基（O-2·）等活性氧物質（Reactive oxygen species，ROS）。超量活性氧物質的存在會造成植物體內DNA、蛋白質被破壞以及膜脂過氧化等傷害癥狀[30]。此時，SOD、POD和CAT等抗氧化酶在去除環境應激活性氧方面發揮著重要作用[31]。SOD可以有效清除植物體內多余的活性氧，是植物抗氧化酶系統中首先起作用的酶[32]。在SOD作用下，O-2·發生歧化反應產生大量的過氧化氫，而這些過氧化氫可以在植物體內CAT和POD的作用下被清除。植物葉片內的CAT可以有效清除植物體內多余的過氧化氫。本研究結果表明，接種腸桿菌FM-1能夠更好地激活水蓼葉片中的SOD、POD和CAT的酶活性（表3），加速催化水蓼葉片中O-2·向H2O2的轉變。對于酸模葉蓼，盡管腸桿菌FM-1的接種也提高了酸模葉蓼葉片中POD和CAT的含量，但是相對水蓼而言，提高的幅度不大。因此，在應對鎘-砷復合污染的脅迫時，水蓼的應激機制更為有效，所以在同等條件下，水蓼的根莖葉中可以富集更多的鎘。這與沈亞琴等[33]對接種叢枝菌根可以有效激活玉米的抗氧化酶系統、幫助其緩解膜脂過氧化程度、減輕銻對玉米脅迫的研究結果相似。

抗氧化酶系統并非植物體清除氧化脅迫的唯一途徑，植物還可以通過非酶物質（GSH、PCs）系統消除活性氧物質的脅迫。其中GSH是植物體內的抗氧化劑，當植物受到氧化脅迫時，植物葉綠體及其他細胞區室內會產生較高濃度的GSH參與活性氧物質的清除[34]；PCs可以通過螯合作用清除活性氧，是植物緩解重金屬毒害的重要物質[35-37]。當水蓼和酸模葉蓼根莖葉中鎘、砷含量顯著增加時，其葉片中的MDA含量顯著降低，這表明兩種植物的葉片并未受到膜脂過氧化的傷害，無氧化應激反應[38]。這與秦余麗等[39]對叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhiza）-黑麥草（Lolium multiflorum L.）聯合修復可以有效降低番茄（Lycopersicon esculintum Mill.）葉片中的MDA含量的結果相似。這表明接種腸桿菌雖然促進了葉片中鎘、砷含量的累積，但植物通過抗氧化酶和非酶系統消除了活性氧物質對植物的傷害，從而提高了水蓼和酸模葉蓼的葉綠素含量，有利于植物的生長。

4 結論

（1）接種腸桿菌可以降低根際土壤的pH；接種濃度為3.4×107CFU·g-1土時，水蓼和酸模葉蓼根莖葉中的鎘、砷含量均提高，表明腸桿菌促進了水蓼和酸模葉蓼對鎘和砷的吸收。

（2）接種腸桿菌可以提高水蓼和酸模葉蓼葉片中葉綠素及類胡蘿卜素的含量，同時提高株高和株質量，表明腸桿菌能夠促進水蓼和酸模葉蓼的生長。

（3）接種腸桿菌可以提高水蓼和酸模葉蓼葉片中SOD、POD、CAT的活性，同時提高植物葉片中GSH及PCs的含量，降低O-2·及MDA的含量，有效緩解了重金屬對植物的毒害。