富里酸對土壤中DnBP的降解及微生物活性的影響

劉厶瑤，李玉雙，*，侯永俠，宋雪英，徐 碩，魏建兵，趙曉旭

鄰苯二甲酸酯類（Phthalic acid esters，PAEs）又稱酞酸酯，具有較強的生殖毒性效應和內分泌干擾效應，部分PAEs對動物還具有致畸、致突變作用，對生態(tài)環(huán)境構成了極大危害，對人體健康構成了嚴重威脅[1-2]。周生賢[3]報告指出，我國約有1000萬hm2耕地受到了污染，占全國總耕地面積的8.3%。大氣沉降、污水灌溉、垃圾堆放、塑料薄膜使用等直接或間接途徑導致土壤受到PAEs污染，使土壤成為PAEs污染物的集合地[4-6]。調查數據表明，我國多地工業(yè)、農業(yè)區(qū)土壤遭受了PAEs不同程度的污染，污染水平一般在0.09 μg·kg-1至45.67 mg·kg-1，蔬菜基地和灌區(qū)污染相對較為嚴重，在不同的PAEs組分中，鄰苯二甲酸正二丁酯（Di-n-butyl phthaiate，DnBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯[Di-（2-ethylhexylPhthalate，DEHP）]的檢出率和污染水平較高[7-9]。目前，環(huán)境中PAEs的降解主要包括非生物降解和生物降解。其中非生物降解包括水解和光解等，而生物降解又包括好氧生物降解與厭氧生物降解兩種形式。土壤環(huán)境中PAEs難以通過水解或光解去除，微生物降解被認為是PAEs從土壤環(huán)境中消減的主要途徑，對影響PAEs在環(huán)境中的歸宿起著關鍵作用[10]。

富里酸（Fulvic acid，FA）是廣泛存在于土壤、沉積物和水環(huán)境中的溶解性有機質，是土壤腐殖質的重要組分之一[11]。FA的分子結構與腐殖質的其他組分（胡敏酸和胡敏素）具有相似性，含有大量羧基、醇羥基、酚羥基、醌型羥基和酮型羥基等官能團[12]。FA的分子中包含疏水結構，因而其具有結合土壤中有機污染物的能力，影響土壤有機污染物的環(huán)境歸宿，引起了環(huán)境科學及其相關領域學者們的廣泛關注[13]。Luc等[14]研究發(fā)現土壤或沉積物中FA能夠明顯增強多環(huán)芳烴的水溶性，加速多環(huán)芳烴在土壤剖面中的垂直移動。土壤淋溶試驗表明，在溶解性富里酸（FDOM）持續(xù)淋溶條件下，土壤中多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的淋失率可達到92%左右[15]。分別從沉積物和土壤中分離出富里酸，然后測定芘在富里酸-水體系中的KOC值，結果表明溶解性的富里酸對芘的親和力隨自身芳香性的增加而加強，而且富里酸的芳香性越高，KOC值越小[16]。

目前，關于腐殖質組分FA對土壤中DnBP的降解動力學及土壤微生物活性方面的研究尚鮮見報道。因此，本文以結構典型且在我國農業(yè)土壤中檢出率和污染水平較高的DnBP為目標污染物，采用土壤培養(yǎng)試驗，研究了FA對土壤中DnBP的降解動力學過程、土壤基礎呼吸和土壤酶活性的影響規(guī)律，以期為深入理解PAEs在土壤中的降解行為及其污染土壤生物修復提供理論基礎和數據依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自遼寧省沈陽市新民蔬菜基地農田，采樣點地理坐標為41°48'41″N、122°50'47″E，采樣深度0～20 cm。將土壤樣品充分混合均勻，自然風干，研磨過2 mm篩，保存?zhèn)溆谩Ｍ寥李愋蜑槌弊厝溃洔y定土壤pH為5.81，有機質含量為3.01%，總氮含量為0.21%，總磷含量為0.024%。

供試富里酸（FA）購于南京都萊生物技術有限公司；DnBP標準溶液（1000μg·mL-1）購于百靈威科技有限公司；所用丙酮、二氯甲烷、正己烷等有機試劑均為色譜純試劑，且經色譜檢驗無雜峰；無水硫酸鈉（分析純）在馬弗爐中于400℃條件下烘干4 h；玻璃器皿均用重鉻酸鉀洗滌液浸泡、洗凈后，于450℃烘4 h，備用。

1.2 污染土壤制備

結合本地區(qū)自然狀態(tài)下土壤中富里酸的含量，設置土壤中富里酸的處理濃度為10、20、40、80、160 mg·g-1（分別記作F1、F2、F3、F4、F5）。首先向每份400 g的土壤中加入不同質量的FA，使土壤中FA的濃度達到設定梯度，充分混合均勻；同時設不含FA的對照處理組（CK）。將一定量DnBP溶于丙酮中，配成設定濃度的DnBP丙酮溶液，然后按50 mL·kg-1土壤的比例添加到上述土壤中，充分混合均勻，放在通風櫥內室溫風干7 d，待丙酮自然揮發(fā)后，再次充分混合均勻、分裝。土壤中DnBP處理濃度為：100 mg·kg-1。同時每個處理保留一份50 g左右的土壤于紙袋中，用于污染土壤中DnBP濃度測定。

1.3 土壤培養(yǎng)試驗

準確稱取15.000±0.002 g土壤樣品于250 mL三角瓶中，將土壤樣品均勻平鋪于錐形瓶底部，按土壤田間持水量的60%加入純水（從此刻開始計算培養(yǎng)時間）。然后用鋁箔紙封口，在鋁箔紙中央打孔，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25℃，濕度80%，每隔2 d稱量三角瓶的總質量，計算水分損失量，補充水分，維持土壤含水量。每個處理24個重復。

分別于第5、10、15、20、25、30、35、40 d培養(yǎng)試驗開始時的相同時刻，將三角瓶用帶有雙通閥的膠塞密封，關閉雙通閥，密閉培養(yǎng)24 h后在雙通閥的一端連接50 mL注射器，打開雙通閥，抽取三角瓶內的氣體，吸打混合3次后抽取瓶內氣體20 mL，關閉雙通閥，連同三通閥一起取下注射器，防止采集的氣體溢出，采集的氣體樣品于12 h內完成測試。同時采集土壤樣品，用于土壤酶活性測定和土壤中DnBP含量分析。用于酶活性測定的土壤置于紙袋中，放冰箱4℃冷藏保存，3 d內完成測定；用于DnBP含量測定的土壤于室溫風干，過20目篩，冰箱冷凍保存，備測。每個處理3個重復。

1.4 樣品分析

土壤中DnBP提取采用超聲波提取法[17]，提取液中DnBP含量分析采用氣相色譜法[18，20]。色譜分析條件為：進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為300℃。柱升溫程序：150℃保持0.5 min，5℃·min-1升溫至220℃，3℃·min-1升溫至255℃，30℃·min-1升溫至280 ℃，保持10 min，載氣流量為1.2 mL·min-1。不分流進樣模式，進樣體積為1μL。以3倍信噪比作為方法檢出限，DnBP的檢出限為：0.01 mg·kg-1。DnBP加標回收率為84.33%～94.42%，土壤空白和試劑空白中目標化合物低于檢出限，滿足分析要求。

氣體樣品中CO2含量分析采用GC-FID法進行[21]，氣相色譜儀為CP-7890B（Agilent，USA），色譜柱為Col2：SS-2 m×2 mm Porapak Q（60/80目），檢測條件按文獻方法進行，檢測器溫度為250℃。土壤脫氫酶活性的測定采用TTC還原法[22]；土壤過氧化氫酶活性的測定采用高錳酸鉀滴定法[23]。

1.5 數據分析

采用SPSS18.0軟件進行ANOVA、Pearson相關分析，采用Microsoft Excel進行通徑分析，采用Original 8.5.1進行動力學曲線擬合及制圖。

2 結果與討論

2.1 DnBP在土壤中的降解動力學

將DnBP在土壤中的降解動態(tài)數據進行擬合，結果發(fā)現其在土壤中的降解動力學符合一級反應動力學模型（見圖1），動力學方程及相關參數列于表1。如表1所示，DnBP的一級降解動力學方程的相關系數（R2）均大于0.9，表明該擬合方程能夠準確描述土壤中DnBP殘余量與培養(yǎng)時間的關系。由表中數據可以看出，對照處理組（CK）土壤中DnBP降解的半衰期為5.069 d，添加不同濃度FA各處理組的DnBP降解的半衰 期 為 2.440～3.430 d，約 為 CK 的 48.1%～67.7%。F1～F3（10～40 mg·g-1）處理，DnBP在土壤中的半衰期隨FA濃度的增加而縮短，而當FA的濃度進一步增加時（80～160 mg·g-1），DnBP的降解半衰期出現了變長的趨勢。這表明FA的添加促進了土壤中DnBP的降解，且具有明顯的濃度效應，當FA添加濃度過高時，Dn-BP降解速度減慢。

PAEs具有一定的生物降解性，并且碳鏈越短，降解所需要的時間越短，降解速率越快。王鑫宏[24]研究了DnBP和DEHP在土壤中的生物降解性，降解動力學結果表明，50、100 mg·kg-1的DnBP在土壤中的降解半衰期分別為5.28 d和6.93 d；郭倩[25]在研究不同濃度DnBP在土壤中的降解動力學時發(fā)現，當DnBP處理濃度為100 mg·kg-1時，其在潮棕壤中的半衰期為5.87 d；這些研究結果與本研究對照處理的半衰期相近。李麗等[26]試驗證明，腐殖質加速了PAHs的降解，提高了微生物聚生體的礦化速率；這些研究結果說明富里酸能夠促進土壤中有機污染物的降解，與本文研究結果相一致。

2.2 FA對土壤呼吸作用的影響

圖2為不同濃度FA處理組土壤CO2釋放量隨培養(yǎng)時間的變化情況。如圖2所示，空白對照組（CK）土壤呼吸強度始終保持較低水平，隨培養(yǎng)時間的延長呈現先快速增大而后緩慢減小的趨勢。FA處理各組CO2釋放量隨培養(yǎng)時間的變化規(guī)律與CK類似，但FA處理各組土壤呼吸強度均高于對照組，說明FA的添加促進了土壤的基礎呼吸。在培養(yǎng)第5～10 d，F1～F2（10～20 mg·g-1）處理組CO2釋放量逐漸增加，在培養(yǎng)第10 d時，CO2釋放量達到峰值；在培養(yǎng)第5～15 d，F3～F5（40～160 mg·g-1）處理組 CO2釋放量大幅增加，在培養(yǎng)第15 d時CO2釋放量達到峰值，但CO2釋放量隨著FA濃度的增加而減少，F4（80 mg·g-1）處理組對土壤呼吸強度促進作用最大，峰值期CO2釋放量約為空白對照組的40.87倍；而后隨著培養(yǎng)時間的延長各個處理CO2釋放量均逐漸減少。

圖1 DnBP在土壤中的降解動力學曲線Figure 1 Degradation kinetics of DnBPin soil

表1 土壤中DnBP的降解動力學方程Table 1 The kinetic equation of DnBPdegradation in soil

圖2 不同濃度FA處理土壤CO2日排放量隨培養(yǎng)時間的變化情況Figure 2 Changes of CO2 emissions from soils treated with different concentrations of FA with culture time

FA處理各組土壤呼吸強度均高于對照組，說明FA的添加促進了土壤的基礎呼吸。但土壤基礎呼吸高峰期與DnBP降解高峰期并不一致，分析其原因可能主要為：培養(yǎng)初期添加了富里酸、DnBP使土壤環(huán)境的穩(wěn)定性發(fā)生變化，土壤微生物活動隨之發(fā)生改變，而當微生物適應新的生存環(huán)境后，優(yōu)勢菌群大量繁殖，同時富里酸、DnBP及其代謝產物為土壤微生物的繁殖提供了碳源和能源，微生物活性增強，釋放CO2的量隨之上升，而培養(yǎng)后期隨著DnBP的降解及可被微生物利用的碳源在土壤中的減少，微生物活動下降，其基礎呼吸降低，逐漸趨于穩(wěn)定。孟婷婷等[27]將含有較多天然腐植酸的褐煤添加到黑土中，其結果表明褐煤的加入促進了土壤的基礎呼吸，與本文研究結果一致。

2.3 FA對土壤酶活性的影響

2.3.1 FA對土壤過氧化氫酶活性的影響

土壤過氧化氫酶（CAT）是一種氧化還原酶，過氧化氫酶可促使H2O2分解為分子氧和水，清除過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一[28]。圖3為不同濃度FA處理各組土壤過氧化氫酶活性隨培養(yǎng)時間的變化情況。如圖3所示，培養(yǎng)第5 d時，F1～F2（10～20 mg·g-1）處理組的過氧化氫酶活性顯著高于對照處理組（P＜0.05），F3～F5（40～160 mg·g-1）處理組的過氧化氫酶活性顯著低于對照處理組（P＜0.05）；總體上表現出酶活性隨FA處理濃度的增加而減小的特征。然而，隨著培養(yǎng)時間的延長，除F4～F5（80～160 mg·g-1）處理組外（P＜0.05），其余FA處理組與對照處理之間的過氧化氫酶活性差異減小。FA處理各組過氧化氫酶活性隨培養(yǎng)時間的變化趨勢與對照處理相似，均表現為先增大再減小的趨勢。

藺浩然等[28]得出不同比例蚯蚓糞配施腐植酸對土壤過氧化氫酶有促進作用，但過量使用不一定得到理想的效果。符昌武等[29]研究結果表明，添加腐植酸能顯著影響還原酶活性、轉化酶活性及根系活力，這些研究結論與本文研究得出的結果相似。

2.3.2 FA對土壤脫氫酶活性的影響

土壤脫氫酶是各種代謝反應的常用酶，借助于有機物的氧化反應制造能量，體現了土壤微生物的整體活性，可以評估微生物的氧化還原能力，能夠反應出土壤微生物對有機物的降解能力的高低。圖4為不同濃度FA處理土壤脫氫酶活性隨培養(yǎng)時間的變化情況。如圖4所示，培養(yǎng)第5 d時，FA處理各組與對照處理組之間差異顯著（P＜0.05），在培養(yǎng)10～15 d，除F1～F2（10～20 mg·g-1）處理組外，其余FA處理組脫氫酶活性顯著高于對照處理組（P＜0.05）。在培養(yǎng)第15 d時，FA處理各組脫氫酶活性達到最大，F1～F2（10～20 mg·g-1）處理組表現出酶活性隨FA處理濃度的增加而增大的特征，而當FA用量進一步提高，即F3～F5（40～160 mg·g-1）處理時，土壤脫氫酶活性逐漸降低。隨著培養(yǎng)時間的延長，FA處理組與對照處理組之間土壤脫氫酶活性的差異減小，這一變化趨勢與FA濃度對土壤脫氫酶活性的影響規(guī)律相似。

圖3 不同濃度FA處理土壤過氧化氫酶活性隨培養(yǎng)時間的變化Figure 3 Changes of catalase activity in soil treated with different concentrations of FA with culture time

劉晶晶等[30]研究結果也表明隨著黃腐酸用量增加，脫氫酶活性呈先升高后降低的趨勢。這說明土壤酶活性與FA之間具有明顯的量效關系，適量施用FA對土壤酶活性的提高有利，而少量或過量施用并不能取得較為理想的效果。

2.4 FA用量、土壤酶活性及土壤呼吸強度與DnBP微生物降解的相關性

由表2可以看出，土壤中DnBP的降解率與土壤呼吸強度、土壤脫氫酶活性之間表現出顯著正相關關系；而FA用量與土壤呼吸強度、土壤脫氫酶活性之間呈顯著正相關關系，與土壤過氧化氫酶活性表現為顯著負相關關系。土壤呼吸強度與土壤過氧化氫酶活性呈顯著負相關關系，與土壤脫氫酶活性具有顯著正相關關系。通徑分析結果（表3）顯示，土壤呼吸強度與土壤中DnBP降解率之間的直接通徑系數和綜合通徑系數均較大，說明其直接作用明顯，并最終表現出強烈的綜合正向作用。FA用量、土壤呼吸強度與土壤中DnBP降解率直接通徑系數較大，說明其直接作用明顯，促進了土壤中DnBP的降解，且主要通過過氧化氫酶活性表現出強烈的間接反向作用，說明FA用量、土壤呼吸強度與過氧化氫酶活性之間的間接作用對土壤中DnBP降解率影響較大；土壤脫氫酶直接通徑系數較小，但通過其與FA用量、土壤呼吸強度、過氧化氫酶活性之間的相互作用最終表現為間接正向作用。

圖4 不同濃度FA處理土壤脫氫酶活性隨培養(yǎng)時間的變化情況Figure 4 Changes of soil dehydrogenase activity in different concentrations of FA treated with culture time

表2 FA用量與土壤中DnBP降解率、土壤呼吸強度及土壤酶活性之間的相關系數Table 2 Correlation coefficient between FA dosage and DnBPdegradation rate，soil respiration rate and soil enzyme activity in soil

表3 土壤中DnBP降解率與FA用量、土壤呼吸強度、土壤酶活性之間的通徑系數Table 3 Path coefficient between DnBPdegradation rate and FA dosage，soil respiration intensity and soil enzyme activity in soil

上述分析結果說明FA的施加促進了土壤微生物活動，土壤脫氫酶活性和土壤呼吸強度的增加，使菌群的氧化還原能力增強，從而加快了土壤中DnBP的降解利用，縮短了DnBP在土壤中的半衰期。但隨著FA用量的增加，會導致土壤pH降低，主要通過過氧化氫酶的強烈反向作用，影響DnBP在土壤中的降解過程[31]。這可能主要基于兩方面原因：一方面，FA進入土壤后，土壤外源碳含量增加，外源碳的分解向土壤中的微生物提供了營養(yǎng)，促進了微生物的生命活動[32]，從而促進了土壤中DnBP的降解；另一方面，FA的分子中存在大量羧基、醇羥基、酚羥基、醌型羥基和酮型羥基等活性官能團[12]，這些活性官能團與土壤中DnBP能夠發(fā)生吸附-解吸等相互作用[33]，從而能夠改善土壤微生物活性及其對土壤中DnBP的降解功能。如Chai等[34]報道腐殖質對PAEs的吸附能力與PAEs的性質有關，腐殖質與PAEs之間的吸附主要以非特異的疏水作用為主；宋嬌艷等[35]研究發(fā)現富里酸對鄰苯二甲酸二丁酯的吸附等溫線符合Lagergren二級反應動力學模型，其主要吸附機制為物理吸附，其吸附能力隨著溫度和pH的上升而下降；萬洋[33]研究表明腐植酸能夠與DnBP形成復合物。

3 結論

DnBP在土壤中的降解過程符合一級反應動力學方程，FA的添加加快了DnBP的降解過程，DnBP的降解半衰期縮短為原來的48.1%～67.7%。

FA的添加促進了土壤的基礎呼吸；對過氧化氫酶活性表現出了低濃度促進、高濃度抑制的變化特征；土壤脫氫酶活性主要表現為促進作用，中高濃度FA處理對脫氫酶活性促進作用顯著。

FA的添加與微生物活性間存在顯著相關關系，FA與DnBP降解率之間通過與土壤呼吸強度、土壤脫氫酶活性、土壤過氧化氫酶活性之間的間接效應和直接效應影響土壤中DnBP的降解。