藏東南林芝地區(qū)典型農(nóng)業(yè)土地利用方式對土壤微生物群落特征的影響

張旭博，徐 夢*，史 飛

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，是土壤碳、氮、磷及其他元素生物地球化學(xué)循環(huán)的重要驅(qū)動力。以往許多研究已經(jīng)證明，土壤微生物群落的數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化能夠顯著影響生態(tài)系統(tǒng)過程的速率和功能的發(fā)揮[1-2]，以及生態(tài)系統(tǒng)面對全球變化的穩(wěn)定性[3]。因此，明確不同環(huán)境下土壤微生物群落的構(gòu)建特征及其關(guān)鍵影響因子，是深入理解及預(yù)測生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)、能量循環(huán)及生態(tài)系統(tǒng)功能響應(yīng)全球變化速率及其機制的基礎(chǔ)[4]。土地利用方式是影響土壤微生物群落特征的重要因素之一，不同土地利用方式，特別是自然植被和農(nóng)業(yè)土地利用方式之間的差異對土壤微生物群落組成和活性的影響，在中國[5-7]及世界其他區(qū)域[8-11]均有報道。青藏高原是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，其東南部林芝地區(qū)是雅魯藏布江、怒江、瀾滄江和金沙江等大江的上游水源涵養(yǎng)中心，是重要的森林資源區(qū)，也是生態(tài)脆弱環(huán)境區(qū)[12]。同時，林芝地區(qū)也是西藏糧食主要產(chǎn)區(qū)之一，該區(qū)域農(nóng)業(yè)土地開發(fā)利用歷史悠久且格局多樣[13]。近年來由于該區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展和人口增長壓力的需求，農(nóng)業(yè)用地面積逐年增加，這不僅給維持森林生態(tài)系統(tǒng)帶來了極大挑戰(zhàn)，而且可能對區(qū)域陸地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)及生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生潛在影響。因此，研究藏東南林芝地區(qū)土壤微生物群落對農(nóng)業(yè)土地利用方式的響應(yīng)特征及其關(guān)鍵影響因素，有助于深入認(rèn)識農(nóng)業(yè)土地利用對該區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響，進而為該區(qū)域農(nóng)、林業(yè)土地資源的合理利用和可持續(xù)管理提供科學(xué)依據(jù)。不同的土地利用方式能夠通過影響輸入到土壤中有機碳的數(shù)量和質(zhì)量、土壤理化性質(zhì)及土壤過程[14-16]等對土壤微生物群落產(chǎn)生顯著的影響。許多研究表明，自然植被轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)業(yè)土地利用方式（例如農(nóng)田管理、放牧草地等）后，可能會帶來地上初級生產(chǎn)力下降、凋落物及向地下分配有機碳數(shù)量降低以及土壤理化性質(zhì)改變等一系列變化，從而導(dǎo)致微生物群落數(shù)量[9]、活性[17]以及多樣性[7]的下降。但是，近年來對亞馬孫的一系列研究卻發(fā)現(xiàn)，農(nóng)業(yè)土地利用方式（放牧草地）下土壤細(xì)菌的α-多樣性顯著高于自然植被（原始雨林）[10，18]。這些迥異的結(jié)果表明農(nóng)業(yè)土地利用方式對土壤微生物群落的影響并不唯一，可能取決于土地利用方式的類型、強度、持續(xù)時間等因素，并且具有區(qū)域特性。對于青藏高原的農(nóng)業(yè)土地利用方式，目前研究多關(guān)注放牧等管理措施如何影響土壤微生物群落[19-20]，但是對農(nóng)田種植土壤中微生物群落的響應(yīng)特征仍然認(rèn)識不足。Xu等[21]利用高通量測序?qū)Σ貣|南地區(qū)不同土地利用方式下土壤中叢枝菌根真菌群落進行了分析，發(fā)現(xiàn)農(nóng)田（小麥、青稞）土壤中叢枝菌根真菌的多樣性顯著低于自然草地，但和自然森林土壤無顯著差別。而其他土壤微生物群落如何響應(yīng)該區(qū)域農(nóng)業(yè)土地利用方式，目前仍不清楚。此外，細(xì)菌和真菌在生長速率、碳源分解能力、能量周轉(zhuǎn)等方面有明顯區(qū)別[1]，因此土壤細(xì)菌和真菌群落對農(nóng)業(yè)土地利用方式的響應(yīng)可能存在差異。Jiao等[7]在對黃土高原的研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌群落對土地利用方式變化（退耕還林）的響應(yīng)比土壤真菌群落敏感。目前傳統(tǒng)的微生物測定方法（例如微生物量碳氮、土壤酶活性等）無法將土壤微生物群落區(qū)分出不同種群，而磷脂脂肪酸（PLFA）譜圖法和高通量測序方法可以根據(jù)生物標(biāo)志物將土壤微生物劃分為不同的種群，從而能夠深入分析農(nóng)業(yè)土地利用方式對土壤微生物群落數(shù)量、多樣性及群落組成的影響。藏東南林芝地區(qū)自然植被（森林）轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)業(yè)土地利用方式（例如農(nóng)田種植、放牧草場）后，輸入土壤的有機碳數(shù)量和質(zhì)量、農(nóng)田管理措施等因素以及土壤理化性質(zhì)的改變可能對土壤微生物群落產(chǎn)生顯著的影響。然而，不同土地利用方式下土壤微生物數(shù)量、多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)的異同，尤其是明確哪些土壤微生物類群對農(nóng)業(yè)土地利用方式的響應(yīng)最為敏感，以及導(dǎo)致土壤微生物群落發(fā)生變化的關(guān)鍵環(huán)境因素是什么，亟需進行深入分析。本研究采集藏東南林芝地區(qū)農(nóng)田（小麥種植）及放牧草地這2種農(nóng)業(yè)土地利用方式下的土壤樣品，以自然森林土壤樣品為對照，利用PLFA譜圖法和高通量測序分析不同土地利用方式下土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量、多樣性和群落組成的差異性，并結(jié)合土壤理化指標(biāo)揭示驅(qū)動土壤微生物群落差異的關(guān)鍵因素，以期闡明農(nóng)業(yè)土地利用方式對藏東南地區(qū)土壤微生物的影響特征及其作用機制，為該區(qū)域農(nóng)業(yè)土地資源合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)域概況

本試驗在青藏高原東南部林芝地區(qū)（26°52'～30°40'N，92°09'～98°47'E）進行。該區(qū)平均海拔約為3000 m，年平均溫度為7～16℃，大于10℃年積溫為2272℃，年平均降水量為600～800 mm。林芝地區(qū)約有46%的面積為森林（2.64×106hm2），占西藏全部森林面積的80%。草地面積為2.91×105hm2，其中適合作放牧草場的面積約為5.25×104hm2。林芝地區(qū)是西藏糧食重要產(chǎn)區(qū)之一，適宜農(nóng)業(yè)耕作的土地面積為3×104hm2。該區(qū)的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)耕作為休閑和單作，化肥投入少，機械化程度低，種植的糧食作物主要為小麥和青稞。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集于2013年7月進行。采樣點位于林芝地區(qū)布久鄉(xiāng)卓木村，當(dāng)?shù)卮蟛糠洲r(nóng)田耕作時間為50年以上，施用有機肥，不使用除蟲劑。每年作物種植前進行一次翻耕處理，草地放牧，放牧強度為輕、中度。在典型農(nóng)田（小麥種植）中隨機選取5個樣方（5 m×5 m），每個樣方中隨機采集3個表層土壤（0～20 cm）樣品并混合為一個樣品重復(fù)。同時，在采樣區(qū)域內(nèi)選取放牧草地和自然森林，以同樣的采樣方法進行土壤樣品的采集，即3個土地利用方式處理（農(nóng)田、放牧草地、自然森林），每個處理5次重復(fù)，一共采集15個土壤樣品。所選取的森林是以高山松（Pinusdensata）、川滇高山櫟（Quercus aquifolioides）和林芝云杉（Picea likiangensis var.linzhensis）為主要樹種構(gòu)成的溫帶針闊混交林次生林，林下小喬木和灌木包括花楸（Sorbus pohuashanensis）、小檗（Berbens thunbergii）、胡枝子（Lespedeza bicolor Turcz.）等。所選取放牧草地的主要物種包括蓼科（Polygonum）、紫菀（Aster）、苔草（Carex）、葛縷子（Carum carvi L.）、老鸛草（Geranium）、禾本科（Poaceae）、蛇莓（Duchesnea indica）、米口袋（Gueldenstaedtia verna）等。將采集的土壤樣品挑出可見的石塊、土壤動物和植物殘體，過2 mm篩。用于DNA提取的土壤保存于-20℃，用于PLFA測定的土壤凍干后保存于-20℃，測定土壤礦質(zhì)氮（NH+4-N和NO-3-N）含量的土壤樣品則保存于4℃冰箱。剩余測定土壤其他指標(biāo)的樣品風(fēng)干并在室溫下保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH用1 mol·L-1KCl浸提（土水比為1∶2.5）并用電位法測定。土壤有機碳（SOC）、總氮（TN）含量使用元素分析儀測定（EA1108，Carlo Erba，Turin，Italy）。土壤有效磷（AP）使用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定。土壤含量用0.01 mol·L-1CaCl2溶液浸提（土水比1∶10），并用流動分析儀（TRAACS 2000，Bran and Luebbe，Norderstedt，Germany）測定，有效氮含量為兩者之和。土壤團聚體分組使用濕篩法：首先將250、53、20μm的篩子按次序放置于特制鐵架上方鐵桶內(nèi)，并將100 g風(fēng)干土壤樣品（過2 mm篩）均勻放置于最上層的250μm篩子上。向鐵桶內(nèi)加入2 L去離子水并浸泡5 min后，以振幅4 cm、頻率35次·min-1持續(xù)振蕩10 min。振蕩結(jié)束后，將各級篩子上的土壤顆粒分別洗入鋁盒中，105℃烘干，待鋁盒內(nèi)無明顯積水后，再烘干24 h并稱質(zhì)量。粒徑為250～2000μm的土壤顆粒為大團聚體（Macroaggregate），粒徑為20～53μm和53～250μm的土壤顆粒為微團聚體（Microaggregate）。

1.3.2 土壤微生物量測定（PLFA法）

土壤中PLFAs的提取根據(jù)Frosteg?rd等[22]的方法并稍作改進。首先將5 g凍干土壤樣品用19 mL提取液（氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液=1∶2∶0.8，pH=4）提取其中的全部脂肪酸。將提取的脂肪酸樣品加入硅膠固相萃取柱，分別用6 mL氯仿、6 mL丙酮和3 mL甲醇對硅膠萃取柱進行連續(xù)洗脫，PLFA組分被收集在甲醇相中。之后用1 mL 1∶1的甲醇甲苯溶液和1 mL KOH甲醇溶液（0.2 mol·L-1）將PLFA組分進行甲基化，反應(yīng)生成磷脂脂肪酸甲酯（FAME）。制備好的磷脂脂肪酸甲酯樣品在上樣前加入脂肪酸19：0作為內(nèi)標(biāo)，使用氣相色譜儀測定脂肪酸含量，并用微生物鑒定系統(tǒng) MIDI Sherlock 6.1（MIDI Inc.，Newark，DE）標(biāo)定每種脂肪酸的名稱。

各種PLFA指示的微生物類群參考文獻[22]。提取PLFAs的總量用來表征總的微生物量。革蘭氏陽性細(xì)菌用同型（iso-）和異型（anteiso-）的支鏈飽和脂肪酸（i14：0、i15：0、a15：0、i16：0、i17：0、a17：0）表征；革蘭氏陰性細(xì)菌用直鏈飽和脂肪酸（14：0、15：0、17：0）、單不飽和脂肪酸（16：1ω7c、18：1ω5c）以及環(huán)丙基脂肪酸（cy17：0、cy19：0）表征；放線菌用C10位置上有甲基支鏈的飽和脂肪酸（10Me16：0、10Me17：0、10Me18：0）表征；真菌用脂肪酸18：2ω6，9c和18：1ω 9c表征。

1.3.3 土壤微生物多樣性及群落組成

使用PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories Inc.，Carlsbad，CA，USA）試劑盒提取土壤DNA，使用NanoDrop ND-2000分光光度計（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）測定DNA的質(zhì)量。使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3')和 907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）對細(xì)菌16S rRNA基因進行擴增，使用引物1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和 2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對真菌ITS基因進行擴增，PCR產(chǎn)物純化后送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。測序獲得的原始序列經(jīng)過QIIME平臺篩選和序列優(yōu)化后，依據(jù)97%的相似度劃分 OTU（軟件平臺 Usearch，version 7.0，http：//drive.5.come/uparse/）。 采 用 RDP classifier（verson 2.2，http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學(xué)分析，并在各個分類水平（門、綱、目、科、屬、種）下統(tǒng)計分析各樣本的群落組成，對比數(shù)據(jù)庫為SILVA（Release 119，http：//www.arb-silva.de）細(xì)菌和古菌16SrRNA基因數(shù)據(jù)庫及UNITE（Release 6.0，http：//unite.ut.ee/index.php）真菌ITS基因數(shù)據(jù)庫。使用Mothur軟件計算各個樣本的α-多樣性指數(shù)，其中豐富度用Chao1指數(shù)表征，多樣性用香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon-Weaver diversity）表征。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

使用單因素方差分析（ANOVA）比較3種土地利用方式下土壤理化性質(zhì)、土壤微生物量（PLFA含量）、土壤微生物α-多樣性、細(xì)菌及真菌各種群相對豐度的差異，并用Duncan's multiple range test檢驗各處理間差異的顯著性。使用Pearson法分析土壤微生物量、多樣性指數(shù)及各種群相對豐度與土壤理化指標(biāo)的相關(guān)性。方差分析和相關(guān)性分析使用IBM SPSSStatistics（version 22.0.0.0）進行。微生物群落結(jié)構(gòu)及其影響因子使用基于Bray-Curtis距離矩陣的冗余分析（Distance-based redundancy analysis，db-RDA），3種土地利用方式下群落結(jié)構(gòu)的差異用PERMANOVA進行檢驗，db-RDA分析使用R軟件包vegan進行分析。利用隨機森林模型（Random Forest）分析影響微生物群落在不同土地利用方式下構(gòu)建差異的關(guān)鍵微生物種群及其貢獻，每個物種的貢獻用觀測值和OOB（out-of-bag）預(yù)測值之間的均方誤差增加值（Increase in MSE，%）表征。隨機森林用R軟件包randomForest進行運算分析，每個物種對預(yù)測模型貢獻的顯著性用軟件包rfPermute計算。db-RDA分析及隨機森林計算結(jié)果使用R軟件包vegan及ggplot2進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 土地利用方式對土壤理化性質(zhì)的影響

農(nóng)田耕作和放牧顯著改變了土壤理化性質(zhì)（表1）。與自然森林相比，農(nóng)田和放牧草地土壤的pH分別升高了2.48個和0.54個單位，SOC及TN含量分別降低了52.5%～69.5%和35.9%～63.3%。土壤AN含量，農(nóng)田土壤（1.30±0.48 mg·kg-1）顯著低于草地和森林土壤（8.16～9.45 mg·kg-1），而土地利用方式對土壤AP含量沒有顯著影響。此外，農(nóng)田土地利用方式顯著影響了土壤物理性質(zhì)。與森林相比，農(nóng)田和放牧草地土壤大團聚體數(shù)量降低了16.0%～20.7%，而微團聚體數(shù)量則增加了36.2%～39.9%。農(nóng)田耕作增加了土壤黏粉粒含量，質(zhì)地為粉壤土，而森林和放牧草地土壤為砂壤土。

2.2 土地利用方式對微生物群落生物量及α-多樣性的影響

表征土壤微生物群落生物量的PLFA含量在不同土地利用方式下有顯著差異（表2）。農(nóng)田和放牧草地土壤中提取的PLFA總量相比于自然森林分別降低了51.8%和38.7%。對于各類微生物功能群，其在土壤中的微生物量也均表現(xiàn)為森林＞農(nóng)田、放牧草地。相比于自然森林，農(nóng)田和放牧草地土壤中革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、放線菌和真菌的生物量分別降低了 26.1%～47.6%、40.0%～61.1%、44.1%～60.6%和5.2%～31.3%。

土壤細(xì)菌和真菌α-多樣性指數(shù)（豐富度Chao、香農(nóng)多樣性）在不同土地利用方式下差異顯著（P＜0.05），且均為森林＞放牧草地＞農(nóng)田（表2）。相比于自然森林，農(nóng)田和放牧草地土壤中細(xì)菌群落的豐富度、香農(nóng)多樣性分別降低了10.5%～15.7%和2.2%～5.1%。土壤真菌群落多樣性對農(nóng)業(yè)土地利用的響應(yīng)比細(xì)菌群落敏感，農(nóng)田和放牧草地土壤中真菌豐富度和香農(nóng)多樣性比自然森林分別降低了8.4%～53.0%和31.8%～71.4%。

2.3 農(nóng)業(yè)土地利用對微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)菌群落中的主要種群在農(nóng)田、放牧草地和自然森林土壤中的分布有明顯差異（圖1）。農(nóng)田土壤中放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度（25.4%）顯著高于放牧草地和自然森林土壤（17.6%～20.9%），然而浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度則相對于放牧草地和森林分別降低了 33.1%～43.5%、32.9%～35.9% 和43.3%～57.1%。擬桿菌門（Bacteroidetes）和藍(lán)藻門（Cyanobacteria）在放牧草地土壤中的相對豐度（6.5%、6.1%）顯著高于農(nóng)田（3.1%、0.3%）和森林（3.8%、0.4%）土壤。其他優(yōu)勢細(xì)菌種群（在門水平上相對豐度大于1%），例如變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）對不同土地利用方式的響應(yīng)不顯著。

與細(xì)菌群落相比，土壤真菌群落組成對土地利用方式的響應(yīng)更加敏感（圖1）。子囊菌門（Ascomycota）是自然森林土壤真菌群落中的優(yōu)勢種群（相對豐度57.9%，主要的優(yōu)勢綱是糞殼菌綱Sordariomycetes），而農(nóng)田耕作和放牧導(dǎo)致其在土壤中的相對豐度分別降低了89.6%和67.7%。農(nóng)業(yè)土地利用顯著提高土壤中擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（優(yōu)勢種群為傘菌綱Agaricomycetes）的相對豐度，其在農(nóng)田（90.8%）和放牧草地土壤（75.9%）中的相對豐度分別是森林土壤（8.0%）的11.4倍和9.5倍。此外，農(nóng)業(yè)土地利用導(dǎo)致接合菌門（Zygomycota）的相對豐度相較于自然森林（4.6%）顯著降低了58.7%～67.4%（P＜0.05）。

表1 3種土地利用方式下土壤理化性質(zhì)特征Table 1 Soil general properties under three land use types

表2 3種土地利用方式下土壤微生物群落PLFA含量及α-多樣性指數(shù)Table 2 PLFA concentrations and diversity indicesof soil microbial community under different land use types

圖1 不同土地利用方式下土壤細(xì)菌和真菌群落組成Figure 1 Composition of soil bacterial and fungal communities under different land use types

基于距離矩陣的冗余分析（db-RDA）結(jié)果表明，不同土地利用方式下土壤細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)有顯著差異（P＜0.05）（圖2）。利用隨機森林模型分析，進一步揭示了導(dǎo)致土壤細(xì)菌和真菌群落構(gòu)建在3種土地利用方式下發(fā)生差異的關(guān)鍵微生物類群（細(xì)菌或真菌屬）及其貢獻。對于土壤細(xì)菌，顯著影響（P＜0.05）3種土地利用方式下群落構(gòu)建差異的細(xì)菌屬主要為Actinoallomurus（Increase in MSE=2.20%）、Chthoniobacter（1.99%）、Thermosporothrix（1.98%）、Mucilaginibacter（1.95%）等，并且這些種群基本都不屬于群落中的優(yōu)勢種（在所有樣品中的平均相對豐度都小于5%）（圖3）。而對于土壤真菌，顯著影響（P＜0.05）3種土地利用方式下群落構(gòu)建差異的真菌屬主要為Inocybe（3.93%）、Emericella（2.93%）、Guehomyces（2.93%）、Wardomyces（2.52%）、Cylindrocarpon（2.52%）等，并且除了Wardomyces屬在森林土壤中的相對豐度達(dá)到6%外，其他各屬在土壤中的相對豐度均小于4%（圖4）。

2.4 環(huán)境因子對土壤微生物群落的影響

相關(guān)性分析表明，土壤pH是影響土壤微生物量及多樣性的關(guān)鍵環(huán)境因子（表3）。土壤微生物生物量（革蘭氏陰性細(xì)菌、放線菌、真菌PLFA含量及PLFA總量）、細(xì)菌和真菌群落的多樣性指數(shù)（豐富度、香農(nóng)多樣性）均與土壤pH顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。SOC和TN含量與微生物多樣性指數(shù)、革蘭氏陰性細(xì)菌PLFA含量有顯著正相關(guān)關(guān)系，土壤有效氮含量與真菌PLFA含量有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。革蘭氏陽性細(xì)菌PLFA含量顯著受到土壤C/N的影響（P＜0.01）。

圖2 不同土地利用方式下土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及其關(guān)鍵影響因子的冗余分析（基于距離矩陣）Figure 2 Differences in the structure of soil bacterial and fungal communities and the controlling factors among three land use types based on distance-based redundancy analyses

圖3 不同土地利用方式下土壤細(xì)菌群落構(gòu)建差異的指示種群（屬水平）的隨機森林預(yù)測分析Figure 3 Resultsof random forest analyses that identifying the microbial indicators（at genus level）that can predict the differences in soil bacterial community among threeland use types

db-RDA分析表明，土壤pH、SOC、TN含量及土壤C/N是顯著影響土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子（圖2）。在綱水平上，真菌群落中主要種群（平均相對豐度大于1%）的相對豐度在3種土地利用方式下的差異與4個關(guān)鍵環(huán)境因子顯著相關(guān)（P＜0.05）（表3）。Agaricomycetes的相對豐度與土壤pH正相關(guān)，與SOC、TN含量及C/N顯著負(fù)相關(guān)，而其他綱（例如 Sordariomycetes、Dothideomycetes、Tremellomycetes、Chytridiomycetes等）則與土壤pH負(fù)相關(guān)，與SOC、TN含量及C/N顯著正相關(guān)。與真菌相比，細(xì)菌群落的主要綱與環(huán)境因子的相關(guān)性相對較弱。土壤pH顯著影響α-Proteobacteria（正相關(guān)）、Bacilli和Ni-trospira（負(fù)相關(guān)）的相對豐度。Nitrospira和Spartobacteria的相對豐度與SOC、TN含量及土壤C/N顯著正相關(guān)，而β-Proteobacteria和Cytophagia的相對豐度與土壤C/N顯著負(fù)相關(guān)。此外，土壤AP含量顯著影響Actinobacteria、Acidimicrobiia（負(fù)相關(guān)）和Planctomycetacia（正相關(guān)）的相對豐度，而Acidobacteria的相對豐度則顯著受到土壤AN的影響（P＜0.01）。

圖4 不同土地利用方式下土壤真菌群落構(gòu)建差異的指示種群（屬水平）的隨機森林預(yù)測分析Figure 4 Resultsof random forest analyses that identifying the microbial indicators（at genus level）that can predict the differences in soil fungal community among three land use types

3 討論

自然植被轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)業(yè)土地利用方式（農(nóng)作物種植、放牧等），通常會導(dǎo)致一系列土壤環(huán)境因子，包括碳輸入的數(shù)量和質(zhì)量、土壤物理及化學(xué)性質(zhì)等的劇烈變化[14-16]，從而顯著影響土壤微生物群落的數(shù)量、組成和活性[8-10]。本研究結(jié)果表明，在藏東南林芝地區(qū)，農(nóng)業(yè)土地利用方式導(dǎo)致土壤微生物群落的總生物量較自然植被顯著降低了38.7%～51.8%（表2）。在其他區(qū)域或不同氣候環(huán)境下，例如中國紅壤地區(qū)[5]、加利福尼亞中部沿海地區(qū)[8]、肯尼亞西部[9]及熱帶雨林地區(qū)[11]等，也有研究報道了森林轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)業(yè)利用后導(dǎo)致土壤微生物量下降的現(xiàn)象。本研究中，自然森林到農(nóng)業(yè)土地利用方式的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致土壤pH增加了0.54～2.48個單位（表1），而土壤pH的變化對土壤微生物量有關(guān)鍵的影響（表3），尤其是對革蘭氏陰性細(xì)菌（r=-0.842，P＜0.01）和真菌（r=-0.795，P＜0.05）。除了土壤pH，SOC和TN含量的增加顯著提高革蘭氏陰性細(xì)菌的生物量，這反映了革蘭氏陰性細(xì)菌群落生存的“r-策略”：生長迅速，但碳源底物利用效率低（生長效率低），因而偏好碳源底物有效性高的環(huán)境[23]。與“r-策略”相反，“K-策略”的微生物，例如革蘭氏陽性細(xì)菌，則能夠?qū)⑻荚磧Υ嬖诩?xì)胞內(nèi)，消耗速率緩慢（碳源利用效率高），并且細(xì)胞壁富含肽聚糖且較厚，因此本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性細(xì)菌對土地利用方式轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的土壤pH及碳源有效性的響應(yīng)并不顯著，而只與土壤C/N顯著正相關(guān)（r=0.844，P＜0.01）。真菌生物量和土壤AN含量有顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.742，P＜0.05），可能是由于氮有效性的提高降低了其對真菌代謝的限制，真菌不需要分泌更多的胞外酶來分解有機質(zhì)以獲得氮源底物，因此更多的碳被分配到生物量構(gòu)建而非胞外酶合成，從而導(dǎo)致真菌生物量增加。土壤微生物量是評價土壤肥力和質(zhì)量的重要參數(shù)，因此農(nóng)業(yè)土地利用情況下（農(nóng)田和放牧草地）土壤微生物數(shù)量的劇烈下降說明在藏東南區(qū)域農(nóng)業(yè)活動對土壤質(zhì)量有負(fù)面影響。此外，土壤微生物量碳以及死亡后的殘留成分（例如氨基糖）也是構(gòu)成和維持土壤有機碳貯存的重要組分，農(nóng)業(yè)土地利用方式下土壤微生物數(shù)量的下降從長期來看也不利于該區(qū)域土壤有機碳庫的貯存和穩(wěn)定。因此，如何在保障產(chǎn)量的前提下維持土壤微生物數(shù)量或者盡量減緩其降低，是該區(qū)域農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及土地利用需要進行探索的方向。

表3 土壤微生物量、多樣性指數(shù)及各種群相對豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation coefficients（r）of soil microbial biomass，diversity index and relative abundance of various groups with soil general properties

以往對植物和動物群落的研究發(fā)現(xiàn)，人類活動造成的生態(tài)系統(tǒng)或環(huán)境的轉(zhuǎn)變能夠?qū)е碌厣虾偷叵律锶郝涠鄻有缘慕档蚚24]。本研究也得到類似的結(jié)果，即土壤細(xì)菌和真菌群落的α-多樣性在自然森林下顯著高于農(nóng)業(yè)土地利用條件下（表2）。Jiao等[7]在黃土高原退耕還林樣地的研究也發(fā)現(xiàn)，還林20年以上的土壤細(xì)菌和真菌群落的α-多樣性顯著高于農(nóng)田。然而在亞馬孫雨林的一些研究卻發(fā)現(xiàn)，自然森林轉(zhuǎn)變?yōu)榉拍敛莸睾笸寥兰?xì)菌群落的α-多樣性增加[10，18]。土壤微生物群落多樣性對森林-農(nóng)業(yè)土地利用方式轉(zhuǎn)變的不同響應(yīng)很可能是由于不同區(qū)域地上、地下生產(chǎn)力差異而造成的。在上述提到的亞馬孫地區(qū)的研究中，盡管熱帶雨林地上初級生產(chǎn)力高，但是地下初級生產(chǎn)力低，而轉(zhuǎn)變?yōu)榉拍敛莸貥O大提高了地下初級生產(chǎn)力[25]，從而促進了土壤細(xì)菌群落α-多樣性的增加。而在林芝地區(qū)，以高山松、林芝云杉和川滇高山櫟為主要樹種的針闊混交林下混有胡枝子、花楸等林下灌木，地上和地下初級生產(chǎn)力均高于農(nóng)田和放牧草地，很可能是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)土地利用方式下土壤細(xì)菌和真菌群落的α-多樣性顯著降低的重要原因。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)業(yè)土地利用導(dǎo)致的土壤微生物多樣性下降與土壤pH的升高有極顯著的相關(guān)性（表3）。最近對全球189個位點、7560余份土壤樣品的分析表明，土壤pH是決定土壤細(xì)菌群落物種及功能多樣性的關(guān)鍵環(huán)境因子，但是和土壤真菌多樣性的相關(guān)性較弱[26]。然而在本研究中，真菌群落的豐富度對pH變化的響應(yīng)最敏感（r=-0.951，P＜0.001）。這種結(jié)果差異，一方面說明了土壤微生物在局部區(qū)域的生物地理分布模式及其影響因子通常與全球模式無法完全吻合。另一方面，真菌的生物學(xué)特性可能限制其擴散條件，并且碳源底物類型也會限制某些真菌的生長，因而本研究觀測到的真菌多樣性和土壤pH的高相關(guān)性，很可能實質(zhì)上是受到土地利用方式改變帶來的植被變化、碳源輸入質(zhì)量和數(shù)量變化的影響，而并非土壤pH的直接調(diào)控作用。土壤微生物的生物多樣性是其發(fā)揮生態(tài)系統(tǒng)功能的基礎(chǔ)[4]，對土壤碳、氮循環(huán)過程尤為重要。農(nóng)業(yè)土地利用方式導(dǎo)致的土壤微生物多樣性降低將如何影響藏東南區(qū)域土壤碳氮循環(huán)過程，是未來需要重點關(guān)注的科學(xué)問題。

除了微生物量和α-多樣性，土壤微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)也受到土地利用方式的顯著影響（圖1和圖2）。目前已有許多研究結(jié)果，例如在亞馬孫地區(qū)的一系列研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田耕作、種植園開墾、放牧等農(nóng)業(yè)土地利用是影響土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的重要因素[10-11，18，27]。本研究中自然森林轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)業(yè)利用后土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的改變與土壤pH的增加、SOC和TN含量及土壤C/N的下降密切相關(guān)（圖2、表3）。但不同土壤微生物種群對農(nóng)業(yè)土地利用方式及其導(dǎo)致的環(huán)境因子變化的響應(yīng)不一，這取決于不同微生物種群在生理及生態(tài)學(xué)特性上的差異。例如，變形菌門的許多細(xì)菌（包括α-Proteobacteria、β-Proteobacteria等）以及擬桿菌門的細(xì)菌多數(shù)是富營養(yǎng)型（Copiotrophic）[28]。我們發(fā)現(xiàn)農(nóng)田土壤中α-Proteobacteria的相對豐度（22.7%±1.7%）顯著高于森林土壤（15.4%±0.2%，P＜0.001），很可能是由于有機肥的施用提高了農(nóng)田土壤肥力。王慧穎等[29]在東北黑土區(qū)的研究也同樣發(fā)現(xiàn)，長期施用有機肥和氮肥顯著提高了α-Proteobacteria在土壤中的豐度。β-Proteobacteria和Cytophagia（屬于擬桿菌門）在放牧草地土壤的相對豐度均顯著（P＜0.01）高于森林土壤，并且與土壤C/N顯著負(fù)相關(guān)，這與以往研究報道的這兩類細(xì)菌偏好利用易分解碳源的結(jié)論一致[28]。相對于富營養(yǎng)菌，貧營養(yǎng)型（Oligotrophic）微生物，例如Acidobacteria通常在土壤養(yǎng)分貧瘠的環(huán)境中有相對高的豐度，這與我們觀察到的Acidobacteria相對豐度隨土壤AN含量升高而降低（r=-0.918，P＜0.01）相吻合。

與土壤細(xì)菌相比，不同土地利用方式下土壤真菌群落組成的變化更加劇烈（圖1），并且不同種群的相對豐度與土壤SOC、TN含量及C/N的相關(guān)性更高（表3）。通常情況下細(xì)菌的生長和周轉(zhuǎn)速率較高，對外界干擾的抗性和恢復(fù)性也可能較高[1]，因而土壤細(xì)菌對農(nóng)業(yè)土地利用方式的敏感性低于土壤真菌。此外，土壤細(xì)菌和真菌對碳源底物的分解能力和偏好不同，某些真菌對碳源底物類型有更嚴(yán)格的需求[1]，這也能夠解釋土壤真菌群落對農(nóng)業(yè)土地利用方式變化的響應(yīng)更多地依賴于土壤碳源底物的有效性（數(shù)量及質(zhì)量）。我們發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)土地利用方式極大提高了擔(dān)子菌門在土壤真菌群落中的優(yōu)勢度（圖1），尤其是Agaricomycetes，其在農(nóng)田和放牧草地土壤中的相對豐度（90.4%，74.1%）分別是自然森林土壤（3.9%）的23.2倍和19倍。Agaricomycetes多為腐生真菌，在有機質(zhì)豐富的環(huán)境中能夠迅速增殖，因此有機肥及牲畜糞便能夠為其提供生長代謝底物，從而促進其相對豐度的增加[29]。并且，Agaricomycetes對養(yǎng)分和能源的競爭優(yōu)勢可能強于其他菌群，因而隨著長期的農(nóng)田耕作及施肥，其他真菌種群逐漸消亡，從而導(dǎo)致真菌群落的物種多樣性顯著下降（表1）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)土壤AN含量顯著影響子囊菌門散囊菌綱（Eurotiomycetes）真菌的相對豐度（r=0.772，P＜0.05），表明這類真菌對土壤無機氮的敏感性較高，但是從生理及生態(tài)學(xué)層面上如何解釋這一結(jié)果目前并不十分清楚。盡管分子生物學(xué)技術(shù)（例如高通量測序）能夠從基因?qū)用鎸ν寥牢⑸锒鄻有浴⑷郝浣M成和構(gòu)建提供更豐富的信息，但目前仍有相當(dāng)一部分土壤微生物的生理及功能未能十分明確。在本研究中，利用隨機森林模型分析，我們發(fā)現(xiàn)了多個在不同土地利用方式下土壤微生物群落構(gòu)建差異顯著的關(guān)鍵種群（圖3和圖4），而這些微生物區(qū)系的變化很可能帶來生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)過程的變化。例如，Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）是一類共生固氮細(xì)菌，同時也有研究發(fā)現(xiàn)它在森林土壤中是優(yōu)勢種群之一[30]。我們發(fā)現(xiàn)Bradyrhizobium在農(nóng)田和森林土壤中的相對豐度顯著高于草地，說明共生固氮過程很可能對農(nóng)田和森林更為重要。此外，我們發(fā)現(xiàn)Flexibacter（屈撓桿菌屬）在草地土壤中的相對豐度顯著高于農(nóng)田和森林，而該屬中的某些種，例如Flexibacter canadensis能夠分泌N2O還原酶從而進行反硝化作用[31]，這反映出草地土壤反硝化過程速率或強度很可能與農(nóng)田和森林土壤有所差異，需要深入研究。

作為西藏土地開發(fā)利用歷史最為悠久的地區(qū)和重要糧食產(chǎn)區(qū)之一，林芝地區(qū)農(nóng)業(yè)土地利用面積正在逐年增加[13]。本研究的結(jié)果表明，自然植被轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)業(yè)土地利用（例如作物種植、放牧等）顯著影響了土壤微生物的生物量、多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)，進而可能對該區(qū)域生物地球化學(xué)循環(huán)、生態(tài)系統(tǒng)過程和功能產(chǎn)生不可忽視的影響。并且，Marshall等[32]在研究草原恢復(fù)過程時發(fā)現(xiàn)，盡管草原恢復(fù)后其植被組成與原始草原相似，但土壤微生物群落卻與原始土壤有顯著差別。Jangid等[33]的研究則發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對土地利用方式變化的響應(yīng)主要是由土地利用歷史所決定，地上部植被類型和土壤理化性質(zhì)對其影響相對較小。這些結(jié)果說明土地利用方式，尤其是農(nóng)業(yè)土地利用對土壤微生物群落的影響可能存在“滯后效應(yīng)（Legacy effect）”，即農(nóng)業(yè)土地利用方式對土壤微生物群落的影響很可能持續(xù)較長時間，即使植被已經(jīng)恢復(fù)，土壤微生物群落的改變?nèi)孕枰喈?dāng)長一段時間才能恢復(fù)到原始狀態(tài)[34]。相比于低海拔地區(qū)，西藏高海拔地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)通常對氣候變化和人類活動的響應(yīng)更加敏感。因此，藏東南地區(qū)農(nóng)業(yè)土地利用方式造成的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的改變將如何影響該區(qū)域陸地生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)，其需要多久才能恢復(fù)到原始狀態(tài)，這是未來需要深入探討的關(guān)鍵科學(xué)問題。

4 結(jié)論

藏東南林芝地區(qū)農(nóng)業(yè)土地利用方式（農(nóng)田種植、草地放牧）通過影響土壤理化性質(zhì)，進而顯著影響了土壤微生物數(shù)量、多樣性、群落組成及結(jié)構(gòu)。相比于自然森林，農(nóng)業(yè)土地利用方式顯著降低了土壤中總PLFA含量及各微生物類群PLFA含量。農(nóng)田和放牧草地土壤中的細(xì)菌群落多樣性顯著低于森林，主要是促進了放線菌門細(xì)菌的生長，而抑制了浮霉菌門、綠彎菌門及厚壁菌門細(xì)菌的生長。土壤真菌對土地利用方式變化的響應(yīng)比細(xì)菌敏感，農(nóng)業(yè)土地利用導(dǎo)致土壤中擔(dān)子菌門傘菌綱Agaricomycetes的相對豐度增加了19～23倍，而其他真菌種群的生長受到抑制，進而導(dǎo)致真菌多樣性的顯著下降。農(nóng)業(yè)土地利用方式顯著影響土壤細(xì)菌和真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)，其變化主要受到土壤pH和碳源有效性驅(qū)動，并且各微生物種群響應(yīng)農(nóng)業(yè)土地利用方式的異同取決于其生理和生態(tài)學(xué)特性（例如富營養(yǎng)型和貧營養(yǎng)型）的差異。