施氮后蚯蚓對植物吸氮及微生物固氮的影響

那立蘋，李宇婷，何紀強，李劍峰，伍玉鵬*

尿素是目前我國使用量最多的氮肥之一，但作為速效氮肥，其施入土壤后在很短的時間內就有約50%會通過氣態(tài)、淋溶和徑流等途徑損失[1]，這不僅造成作物當季氮肥利用率不足40%，還帶來了一系列的環(huán)境問題[2]。減少氮素損失是目前急需解決的農業(yè)問題，提高植物對尿素的吸收利用以及增加尿素氮在土壤中的固存是減少氮素損失的方法。

蚯蚓是土壤動物中常見類群之一，被稱為土壤的“生態(tài)系統(tǒng)工程師”[3]，能夠通過其一系列生命活動影響植物對土壤氮素的吸收利用及氮素在土壤中的轉化過程。一方面，蚯蚓能夠通過促進植物生長來提高植物對土壤氮素的吸收，進而提高土壤氮素利用率[4-5]。Wu等[6]發(fā)現(xiàn)，蚯蚓不僅提高了冬小麥-夏玉米種植體系的作物籽粒產量，也提高了籽粒中的總氮含量和粗蛋白含量。He等[7]則更進一步地揭示了蚯蚓-菌根真菌互作對提高植物氮吸收的促進作用。另一方面，蚯蚓活動會在短時間內大量增加或減少土壤微生物數(shù)量[3]。土壤微生物反應迅速，微生物量氮指示了土壤整體氮轉化和儲存能力。陳珊等[8]發(fā)現(xiàn)，氮素的微生物固持可以減少其以氣態(tài)形式損失，有利于保肥，微生物體內的氮素會在后期被重新礦化釋放出來供作物吸收利用。因此，蚯蚓可能通過調節(jié)微生物量使之成為氮素固存在土壤中的一個緩沖庫。Pang等[9]發(fā)現(xiàn)，蚯蚓可以促進微生物量碳向可溶性有機碳的轉移，從而產生活性更強的微生物，但與此同時，蚯蚓也可能通過取食微生物來增加土壤礦質氮的含量，從而產生大量供植株吸收的無機氮。

已有研究表明，蚯蚓既能夠促進植物對氮的吸收利用，也能夠通過影響微生物的生物量在氮素固持方面發(fā)揮一定作用，但這些研究結果并未區(qū)分蚯蚓對土壤氮及外源肥料氮的不同影響。作為速效氮肥，尿素施入土壤后在較短的時間內即可發(fā)生變化。在此期間，蚯蚓能否促進植物對尿素氮的吸收利用，能否通過調控微生物量形成尿素氮在土壤中的緩沖庫，并不清楚。因此，本研究采用盆栽試驗，通過施用15N尿素，對比有、無蚯蚓作用下尿素氮在植物中的含量及土壤微生物量氮的變化過程，以期探明蚯蚓對尿素氮吸收與轉化的影響。研究結果對于提高作物產量和氮肥利用率，促進農業(yè)生產的可持續(xù)發(fā)展具有重要作用，亦有助于進一步揭示土壤生物在農業(yè)生產中對氮素轉化的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤和蚯蚓均采集自華中農業(yè)大學菜地0～20 cm土層。鮮土采回后剔除石塊、大中型土壤動物及植物根茬，過5 mm篩，調整為61%的孔隙含水率備用（與采樣點土壤含水率一致）。土壤pH為7.67±0.01，有機質含量15.78±0.17 g·kg-1，硝態(tài)氮含量8.34±0.36 mg·kg-1，銨態(tài)氮含量4.24±0.17 mg·kg-1。

蚯蚓為菜地中的優(yōu)勢種——威廉腔環(huán)蚓（Metaphireguillelmi），挑選性成熟且大小一致的個體作馴化處理備用，并于試驗開始前1 d進行清腸。

以油麥菜（Lactuca sativavar longifoliaf.Lam）為試驗作物，種子育苗至4片真葉后，選取茁壯且大小一致的幼苗備用。氮肥采用上海甄準生物有限公司生產的豐度為10%的15N尿素，含量≥99.0%。

1.2 培養(yǎng)試驗

采用溫室盆栽的方法開展試驗，共設接種蚯蚓與不接種蚯蚓（對照）兩個處理。備用土壤按照80 mg·kg-1（以P2O5計）和160 mg·kg-1（以K2O計）的量混入磷肥和鉀肥，裝入長方形塑料盆（長×寬×高為49 cm×20 cm×14 cm）中。每個塑料盆裝入鮮土6 kg，隨后選取2株幼苗進行移栽。待幼苗生長穩(wěn)定后選取健壯且長勢一致的8盆用于試驗（每個處理4個重復）。按照試驗設計，在需接種蚯蚓的處理盆中接種蚯蚓3條（密度約為采樣點的2倍），待蚯蚓順利進入土壤后施入尿素。尿素施入量為200 mg·kg-1（以純N計）[10]，將尿素溶于200 mL水后均勻施入，以保證能夠潤濕全部土壤但又不產生滲濾液，以便讓尿素和土壤混合均勻且避免再次對土壤造成擾動。

隨后，將所有盆置于大棚下進行培養(yǎng)，但依據(jù)實際天氣變化（氣溫、降水量）進行灌溉。盆底部設置有小孔以防盆內積水。

1.3 樣品采集和測定

于施入尿素后的第5 d和第15 d利用微型土鉆（直徑2 cm）采集土樣，每盆隨機采集3個點后將土壤混勻作為一份樣品。在第30 d進行破壞性取土，收獲全部植株并統(tǒng)計蚯蚓存活率。

土壤樣品采用靛酚藍比色法測定土壤銨態(tài)氮（NH+4-N）含量[11-12]；采用紫外分光光度法測定土壤硝態(tài)氮（NO-3-N）含量[11]；采用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測定土壤溶解性有機氮（DON）含量[12]；土壤樣品用去離子水浸提后采用TOC儀（德國元素公司vario）測定[13]溶解性有機碳（DOC）含量。植物樣品采用烘干法測定干質量，全部植株混勻后用元素分析儀（Euro Vector EA3000型）測定植物氮含量[14]；土壤風干后過100目篩，用元素分析儀（Euro Vector EA3000型）測定全氮（TN）含量[15]；采用氯仿熏蒸法測定土壤微生物生物量氮（MBN）、微生物生物量碳（MBC）[9]；植株、土壤及MBN中的15N豐度均用元素分析-同位素質譜聯(lián)用儀測定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

植株從肥料中所吸收的氮累積量（g）=吸氮量（g）×Ndf（f%）[17]

MBN中來自肥料氮的含量（mg·kg-1）=MBN的含量（mg·kg-1）×Ndf（f%）

采用Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理，SPSS20（IBM Corporation，USA）進行數(shù)據(jù)處理與獨立樣本T檢驗，Origin 8.6（Origin Lab Corporation，USA）作圖，結果表示為均值±標準偏差。

2 結果與討論

2.1 蚯蚓活動對植株干質量及吸氮量的影響

培養(yǎng)結束后，接種蚯蚓的處理中蚯蚓全部存活，未發(fā)現(xiàn)增殖情況；雖然與接種前相比蚯蚓生物量有所下降，但二者之間并無顯著差異。表1顯示，培養(yǎng)結束后接種蚯蚓處理的植株干質量為15.63 g·pot-1，顯著高于未接種蚯蚓處理（12.47 g·pot-1）；同時，蚯蚓的活動顯著增加了植株地上部干質量與地下部干質量。接種蚯蚓與未接種蚯蚓的植株含氮量分別為32.83 g·kg-1和31.15 g·kg-1，二者之間無顯著差異。該結果與已有的研究一致，van Groenigen等[4]通過元分析發(fā)現(xiàn)，蚯蚓活動提高作物地上部生物量約23%，尤其是在擾動過的系統(tǒng)中（例如本研究中將土壤混合均勻后重新裝盆），其作用效果可為未擾動土壤的兩倍，但蚯蚓對作物體內的氮含量卻無顯著影響。Braga等[18]也指出蚯蚓可以增加作物產量，但是不會增加作物中的氮含量。在本研究中，雖然兩處理植物含氮量無顯著差異，但總體來看，蚯蚓通過增加植株生物量，顯著提高了植株的吸氮量，與無蚯蚓處理相比，蚯蚓作用下植株總吸氮量提高了約30.8%。

培養(yǎng)結束后，兩處理植株中肥料氮的吸收量及比例均比土壤氮的吸收量及比例高，其肥料氮與土壤氮的吸收比例約為8∶2，說明肥料氮是植株在整個生長發(fā)育過程中的主要氮源（表2）。與對照相比，接種蚯蚓顯著增加了植株對肥料氮和土壤氮的吸收。從分配比例上來看，與對照相比，接種蚯蚓顯著增加了植物吸收土壤氮的比例（18.37%），卻顯著降低了植物吸收肥料氮的比例（81.63%）。本研究結果說明，蚯蚓增加了植株的吸氮量，但其增加部分主要來源于土壤氮，而非肥料氮。Liu等[19]和Hart等[20]發(fā)現(xiàn)，施用肥料增加了植物對土壤本底氮的吸收量，并用“Pool substitution”模型進行了解釋，認為這一現(xiàn)象歸結于氮肥施入后對植物本身的影響（如根系變長、菌根作用）。而蚯蚓對植物根系生物量的促進作用（表1）可能加劇這一過程。

表2 蚯蚓作用下不同氮素來源在植株中的吸收與分配Table 2 Uptake and distribution of different nitrogen sources by earthwormsin plants

表1 蚯蚓活動對植株干質量及吸氮量的影響Table 1 Effectsof earthwormactivities on dry weight and nitrogen uptake of plants

2.2 蚯蚓活動對土壤TN含量的影響

試驗過程中，土壤TN含量在處理間和時間梯度上均無顯著變化（圖1A），這可歸結于較短的培養(yǎng)周期。但整個培養(yǎng)過程土壤TN中肥料氮的貢獻逐漸降低（圖1B）。這與已有的研究結果一致，Bohlen等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在施有無機氮肥的處理中，土壤表層土（0～5 cm）中的15N原子百分超隨培養(yǎng)時間逐漸下降。值得注意的是，接種蚯蚓處理的土壤TN中來源于肥料的氮下降速度更快，并在第15 d和第30 d顯著低于無蚯蚓的處理，說明蚯蚓活動促進了肥料氮在土壤中的損失。這與Bohlen等[21]和Fonte等[22]在表層土壤中觀察到的結果一致，即蚯蚓存在時，土壤中無機氮肥的回收率更低。這可能與蚯蚓打洞導致的滲濾液增加有關[23]，尤其是在本研究中，為防止淹水在盆栽底部設置的排水孔將成為肥料氮損失的一個主要途徑。雖然也有研究認為，蚯蚓能夠通過形成團聚體等方式提高氮素在土壤中的固持[24]，但這一過程需要一定的時間累積。

2.3 蚯蚓活動對土壤微生物生物量的影響

兩處理的MBC含量（圖2A）在整個試驗過程中均先增加后降低。與未接種蚯蚓的處理相比，接種蚯蚓處理始終有較高的MBC含量，并在第15 d產生顯著差異。蚯蚓對MBC的提高作用已得到了較多研究的證實，例如Demetrio等[25]發(fā)現(xiàn)與不接種蚯蚓對比，接種兩條蚯蚓會使土壤中的MBC含量增加75%。

圖1 蚯蚓活動對土壤TN（A）及土壤TN中肥料氮含量（B）的影響Figure 1 The effect of earthwormactivities on total soil N（A）and fertilizer nitrogen content in soil（B）

土壤MBN含量是土壤微生物對氮素礦化與固持作用的綜合反映[26]。本試驗中土壤MBN的變化趨勢與MBC存在較大差異（圖2B）。接種蚯蚓處理的MBN含量先快速下降，然后上升，而未接種蚯蚓處理的MBN含量下降后保持平緩。與對照相比，接種蚯蚓在培養(yǎng)第5 d時顯著增加了MBN含量，而第15 d時則顯著降低了MBN含量。這說明培養(yǎng)前期（第5 d）蚯蚓促進了土壤微生物對氮素的固持，在中期（第15 d）又將固持的氮素釋放出來，即蚯蚓通過調節(jié)微生物量使之成為氮素固存在土壤中的一個緩沖庫。這可能是因為培養(yǎng)前期，施入的尿素為土壤微生物和蚯蚓帶來了大量的易利用氮源，豐富的氮源環(huán)境刺激蚯蚓對土壤中生物可利用碳的活化作用（圖2C），進而顯著提高了培養(yǎng)前期（第5 d）的MBN含量。這一現(xiàn)象在Araujo等[27]和Groffman等[28]的研究中均有報道，即在森林生態(tài)系統(tǒng)中，外來入侵蚯蚓可能通過增加土壤中的礦質碳來使得微生物成為氮的“匯”，從而減緩土壤中氮的礦化和硝化進程，讓氮能夠留存在土壤之中。在培養(yǎng)后期，尿素氮快速損失（圖2D），蚯蚓對微生物的吞噬和消化以及植物迅速生長對養(yǎng)分的需求[29]，可能是導致第15 d接種蚯蚓處理MBN顯著低于無蚯蚓處理的原因。

值得注意的是，接種蚯蚓雖然在培養(yǎng)前期（第5 d）顯著提高了MBN的含量，但在整個培養(yǎng)過程中，MBN中來源于肥料氮的部分始終顯著低于無蚯蚓的處理（圖2D）。說明本研究中蚯蚓通過調節(jié)微生物生物量對氮素形成的緩沖庫主要作用于土壤中本底氮，而非新施入的氮。這一結果可能與施入的氮肥類型有關。蚯蚓作為食腐動物，主要取食有機物質，促進有機氮向無機氮的轉化[30]，而單純的施用化肥則可能對蚯蚓造成不利的影響[31]。若改為施用有機氮（如畜禽糞便），則可能得到相反的結果，但這需要未來進一步的研究進行驗證。

土壤微生物量作為土壤養(yǎng)分的“庫”和“源”，是土壤肥力的一個重要指標，與作物產量的形成密切相關。已有研究表明，土壤微生物量氮是土壤有效氮的重要組分，其消長反映了土壤的供氮特征，微生物吸收同化氮組成的微生物量氮，由蚯蚓吞噬和消化，其分解釋放的氮絕大部分可被植物吸收利用[32-33]。微生物量氮在數(shù)量上低于或接近于作物的吸氮量，但微生物量氮周轉率比土壤有機氮要快[34]。因此，本研究中，接種蚯蚓處理有更高的植物生物量和總吸氮量（表1），這可部分歸結于蚯蚓對MBN的調控作用，而MBN中顯著降低的肥料氮含量（圖2D），則有助于解釋植株體內更低的肥料氮分配比例（表2）。

2.4 蚯蚓活動對土壤可溶性氮組分含量的影響

試驗過程中，兩處理的NH+4-N含量（圖3A）均表現(xiàn)為培養(yǎng)前期（第5 d）高，隨后逐漸降低，而NO-3-N含量（圖3B）則表現(xiàn)為前期（第5 d）低，后期逐漸升高。這是因為尿素進入土壤后在脲酶的作用下3～5 d即轉化成NH+4，NH+4又在微生物的作用下很快轉化成硝酸鹽和亞硝酸鹽[35]。整個培養(yǎng)過程中的NH+4-N含量均為接種蚯蚓處理低于無蚯蚓的處理，并在第15 d和第30 d產生顯著差異，說明蚯蚓促進了NH+4向硝酸鹽和亞硝酸鹽的轉化（硝化過程）。與此同時，接種蚯蚓處理在培養(yǎng)中后期（第15 d及第30 d）較無蚯蚓處理有更低的NO-3-N含量（圖3B），這可能歸因于蚯蚓對NO-3-N反硝化作用的促進。但無論是NH+4-N的硝化過程，還是NO-3-N的反硝化過程，均會產生氮素的氣態(tài)損失[36]。

土壤DON是土壤有機氮中最活躍的一部分，可被植物直接吸收利用，對植物生長及不同生態(tài)系統(tǒng)中氮素循環(huán)起到重要作用[37]。因具有水溶性的特點，土壤DON始終都處于一種動態(tài)變化的化學平衡狀態(tài)，并受土壤中其他理化性質及生物因素的影響。本研究顯示，在培養(yǎng)過程中，各處理的土壤DON均先下降后上升（圖3D），與MBN的變化趨勢一致（圖2B）。這是因為土壤DON是土壤微生物氮的重要來源和儲存庫，Liang等[38]則更進一步證實了土壤MBN與土壤DON之間的顯著關系。一般認為，新近凋落物和土壤腐殖質以及有機質分解的中間產物是土壤DON的主要來源[39]，培養(yǎng)前期接種蚯蚓處理顯著高于無蚯蚓處理的DON含量則可歸結于蚯蚓對有機物質分解的促進作用。也有研究指出單純化肥的施用也能夠增加土壤中DON的含量[40]，這有助于解釋各處理在尿素施用后培養(yǎng)前期（第5 d）有較高的DON含量。培養(yǎng)末期（第30 d），與無蚯蚓處理相比，接種蚯蚓處理顯著降低了DON含量可能是由于培養(yǎng)中后期（第15 d及第30 d）接種蚯蚓處理的微生物快速繁殖過程對DON的同化作用[41]。但本研究并未測定DON的同位素豐度，無法計算DON中來源于尿素氮的比例，也無法估計尿素施入后DON變化對微生物量氮的影響，未來進一步的研究將有助于揭示該問題。

圖2 蚯蚓活動對土壤MBC（A）、MBN（B）、DOC（C）及MBN中肥料氮（D）含量的影響Figure 2 The effect of earthwormactivities on soil MBC（A），MBN（B），DOC（C）and fertilizer nitrogen content in MBN（D）

圖3 蚯蚓活動對土壤NH+4-N（A）、NO-3-N（B）、無機氮（C）及DON（D）含量的影響Figure 3 Effects of earthworm activity on soil ammonium nitrogen（A），nitrate nitrogen（B），inorganic nitrogen（C）and DON（D）content

本研究采用培養(yǎng)試驗，接種蚯蚓和不接種蚯蚓的處理均施入了等量的尿素。研究結果顯示，接種蚯蚓處理并未顯著促進植物對肥料氮的吸收（表1），也未能夠讓肥料氮留存在土壤中（圖1B），即接種蚯蚓增加了肥料氮的損失。這種損失可能來源于兩方面：（1）N2O氣態(tài)損失。前文提及，本研究中的蚯蚓促進了NH+4-N的硝化過程，以及后續(xù)NO-3-N的反硝化過程，從而導致尿素氮以N2O的形式排出土壤。這一觀點亦可從接種蚯蚓處理有更低的無機氮含量（圖3C）得到證實。已有的研究亦指出，蚯蚓能夠增加土壤30%～56%的N2O排放[42]，Jenkinson等[43]發(fā)現(xiàn)肥料氮進入土壤之后可能會在特殊情況下發(fā)生反硝化作用，導致肥料氮的損失，發(fā)生“Pool substitution”現(xiàn)象。（2）滲濾液損失。在試驗過程中觀察到接種蚯蚓處理收集到更多的滲濾液，這可能讓更多的尿素氮隨滲濾液排出土壤。這一現(xiàn)象與Wang等[44]和Dominguez等[23]的研究結果一致。Wang等[44]指出這歸結于蚯蚓對土壤大孔隙的形成及孔隙的上下貫通。

除了調控微生物形成臨時性的氮“庫”，促進作物吸收氮素外，蚯蚓還能通過多種生命活動影響土壤中的氮素循環(huán)。本研究通過15N尿素培養(yǎng)試驗說明，蚯蚓存在并不能促進植物對尿素氮的吸收利用，也不能促進尿素氮在土壤中的留存。這或許與氮肥類型有關，秸稈氮、畜禽糞便氮施入后或許會有相反的結果，這將是下一步的研究重點。

3 結論

（1）接種蚯蚓后，植株生物量與吸氮量均顯著增加，但蚯蚓主要促進了植株對土壤氮的吸收，而非對尿素氮的吸收。

（2）蚯蚓活動顯著增加了土壤全氮中尿素氮損失。

（3）蚯蚓可通過調節(jié)微生物生物量對氮素形成緩沖庫來促進植物生長和對氮素的吸收，但這種調節(jié)主要作用于土壤中原有的氮，而非新施入的尿素氮。

綜上，在今后的農業(yè)生產中，可通過接種蚯蚓來促進植株對氮素的吸收；但是由于蚯蚓活動會增加土壤中尿素氮損失，因此可減少化肥氮的施入或將化肥和有機肥配施，以減少化肥氮的損失，提高氮肥利用率。