白腐真菌對PAHs的吸附和降解特征及Tween 80和Cu2+的強化作用

班巧英，吳東洋，李建政，劉 琦

隨著工農業的迅猛發展，大量有毒有害的難降解污染物進入環境中。作為一類典型的難降解有機污染物，多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的降解引起了研究者的廣泛關注[1-3]。PAHs廣泛存在于各種生境中[4-5]。PAHs自身的高親脂性、高毒性、持久性、生物積累性，是使其成為威脅生態系統安全穩定和人類健康的重要因素。因此，如何將PAHs從環境中去除已成為研究的熱點問題之一。

在自然條件下，PAHs很難被降解，而且降解的難易程度與分子量大小呈正相關[6]。生物方法是當前主要的PAHs污染修復技術之一。白腐真菌是一類可以引起木質白色腐爛的絲狀真菌，其除了能降解木質素外，一些白腐真菌對復雜有機物也有很強的降解能力[7-8]。近年來，白腐真菌被廣泛用于去除環境中的PAHs。例如，Chen等[9]的研究發現，白腐真菌（CW-1）對菲和芘的去除率分別為70%～80%和90%。Hadibarata等[10]的研究表明，經過30 d的連續培養后，大約63%的芘被白腐真菌（Armillaria sp.F022）轉化。白腐真菌（Pseudotrametesgibbosa）以芘作為唯一碳源在18 d內將28.3%芘去除，且加入其他底物后可顯著提高芘的去除率[11]。白腐真菌降解PAHs主要是通過木質素降解酶系轉化途徑[12]。該酶系統中的主要功能酶包括漆酶、錳過氧化物酶（MnP）、木質素過氧化物酶（Lip）。其中，漆酶是一種含銅多酚氧化酶，它的催化過程不需要H2O2的參與，可在碳、氮存在下由菌體分泌，且具有較高的氧化還原電位（780 mV）和很寬的底物范圍[13-14]。研究表明，從Trametes versicolor中分離的漆酶具有對多種PAHs降解的能力，且加入1-羥基苯并三唑后，PAHs的降解率接近100%[15]。Cho等[16]的研究也表明，在氧化還原介體存在的條件下，白腐真菌（Coriolushirsutus）分泌的漆酶可以催化氧化5種PAHs。

盡管白腐真菌降解PAHs的研究已有報道，但有關生物吸附和生物降解在白腐真菌去除PAHs過程中所起的作用及強化PAHs降解的研究相對較少。因此，本研究在解析白腐真菌（黃孢原毛平革菌，Phanerochaete chrysosporium）對萘、菲、芘的吸附、降解特性基礎上，研究了Tween 80和Cu2+對白腐真菌降解PAHs的影響及相應的漆酶活性，闡明了Tween 80和Cu2+強化白腐真菌降解PAHs的酶學機制，為進一步提高白腐真菌降解PAHs的效率，促進其工業化應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

實驗選用的白腐真菌購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium）純菌（編號BNCC 145491）分離自腐爛的木片。

PDA培養基：將去皮馬鈴薯200 g，切塊、放入蒸餾水中煮沸30 min，用雙層紗布過濾，再加入10 g C6H12O6、3 g KH2PO4、1.5 g MgSO4、10 mg 維生素 B1、20 g瓊脂，定容至1 L，121℃高壓滅菌15 min，冷卻、備用。PDB培養基：與PDA培養基相似，去掉瓊脂即可。

1.2 白腐真菌菌球的制備

將白腐真菌涂布于PDA培養基上，在35℃條件下恒溫培養。待菌絲長滿后，用少量無菌蒸餾水沖洗，得到孢子懸液，置于4℃冰箱中保存。取1 mL孢子懸液接種于150 mL PDB培養基中，35℃、120 r·min-1條件下振蕩培養7 d，形成直徑4 mm左右的白腐真菌自固定菌球，備用。

1.3 萘、菲、芘溶液的配制

試驗用廢水為人工配制，萘、菲、芘濃度的設置參考以往的研究[9]。將300 mg萘、10 mg菲、1 mg芘溶于100 mL丙酮溶液中，作為混合母液保存于4℃冰箱，備用。

1.4 白腐真菌對萘、菲、芘的去除試驗

1.4.1 揮發性試驗

取1.0 mL萘、菲、芘混合母液置于250 mL三角瓶中，隔夜待丙酮完全揮發以后，加入100 mL蒸餾水。設置21個平行樣，置于35℃、120 r·min-1避光條件下恒溫振蕩培養，定期取3個樣品測定培養液中萘、菲、芘的濃度。

揮發率=（A0-At）/A0×100%

式中：A0為萘、菲、芘的初始濃度，mg·L-1；At為t時刻培養液中殘留萘、菲、芘的濃度，mg·L-1。

1.4.2 吸附、降解試驗

設置4組試驗：（1）PDB+PAHs（空白對照）；（2）滅活菌+蒸餾水+PAHs（檢測滅活菌的吸附特征）；（3）活菌+蒸餾水+PAHs（檢測活菌的吸附特征）；（4）活菌+PDB+PAHs（檢測活菌的降解特征）。取1.0 mL萘、菲、芘混合母液置于250 mL三角瓶中，隔夜待丙酮完全揮發以后，進行吸附和降解試驗。加入100 mL蒸餾水或PDB培養基、0.2 g（干質量）有活性或滅活白腐真菌。每組試驗設置21個平行樣，置于35℃、120 r·min-1避光條件下恒溫振蕩培養，定期從每組試驗中取3個樣品測定培養液中萘、菲、芘的濃度及白腐真菌生物質中萘、菲、芘的含量。

將3個待測樣品在4000 r·min-1條件下離心15 min，將上清置于分液漏斗中，加入10 mL二氯甲烷，進行萃取，重復3次。將3次萃取液合并，用旋轉蒸發儀干燥后將其溶于5mL正己烷中，然后轉移至裝有2 g硅膠的玻璃柱凈化，并用15 mL正己烷和二氯甲烷（1∶1，V∶V）混合液淋洗，洗脫液收集至圓底燒瓶，再次蒸干后，用4 mL乙腈溶解，過0.22μm濾膜后用于測定溶液中殘留PAHs。采用超聲萃取法提取白腐真菌生物質中的殘留PAHs。在白腐真菌生物質中加入10 mL丙酮和正己烷的混合物（1∶1，V∶V）超聲萃取30 min，重復3次。其余步驟同上。

式中：Bt為t時刻白腐真菌生物質中萘、菲、芘的含量，mg；A0為萘、菲、芘的初始濃度，mg·L-1；At為 t時刻培養液中殘留萘、菲、芘的濃度，mg·L-1；V為培養液體積，L；Vt為t時刻萘、菲、芘的累積揮發率，%。

1.4.3 Tween 80和Cu2+對萘、菲、芘去除的影響

采用單因素試驗（每個因素6個水平）考察Tween 80和Cu2+對萘、菲、芘去除的影響。取1.5 mL萘、菲、芘混合母液置于250 mL三角瓶中，隔夜待丙酮完全揮發以后，加入100 mL PDB培養基、0.2 g（干質量）白腐真菌以及不同濃度的表面活性劑或CuSO4。Tween 80 的濃度為 0（對照）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g·L-1。Cu2+的濃度為 0（對照）、0.01、0.05、0.25、1.25、5.0 mmol·L-1。每組試驗設置3個平行樣，置于35℃、120 r·min-1避光條件下恒溫振蕩培養，10 d后測定培養液中萘、菲、芘的濃度及相應的漆酶活性。

1.5 白腐真菌對萘、菲、芘的吸附動力學分析

白腐真菌對污染物的吸附過程通常符合偽一級動力學和偽二級動力學模型[7]。本研究中，白腐真菌對萘、菲、芘的吸附進程更適合偽一級動力學模型。因此，本研究用偽一級動力學方程擬合吸附動力學參數。將試驗所得數據用統計軟件Origin 9.0擬合出相關動力學參數。

式中：qe為平衡吸附量，mg·g-1；qt為 t時刻的吸附量，mg·g-1；k1為一級速率常數。

1.6 萘、菲、芘濃度及漆酶活性的測定

1.6.1 萘、菲、芘含量測定

萘、菲、芘的定量檢測采用反相高效液相色譜檢測。洗脫程序：流動相包括水和乙腈，乙腈占流動相成分的80%，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃，時間為20 min。

1.6.2 漆酶活性測定

采用漆酶試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行測定。漆酶通常為胞外酶，直接從培養液中取樣測定；在30℃水浴中反應，測定420 nm處3 min內吸光度的差異。反應總體積為1 mL，包括150μL適當稀釋的待測酶液和850μL工作液。漆酶活性定義為每升液體每分鐘氧化1μmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

式中：ΔA為3 min內吸光度差異；V總為反應總體積，1 mL；N為稀釋倍數；ε為ABTS摩爾消光系數，3.6×104L·mol-1·cm-1；V樣為反應體系中酶液體積，0.15 mL；ΔT為反應時間，3 min。

1.7 生物量測定及數據統計分析

生物量測定采用菌體干質量法[17]。試驗結果的統計分析采用SPSS22.0軟件進行。

2 結果與討論

2.1 白腐真菌對萘、菲、芘的吸附特性

2.1.1 萘、菲、芘的揮發性

PAHs普遍具有揮發性。為了更加準確地分析白腐真菌對萘、菲、芘的吸附和降解特征，首先測定了這3種PAHs的揮發性，結果如圖1所示。在萘、菲、芘的初始濃度分別為30、1、0.1 mg·L-1和35 ℃條件下，3種PAHs的累積揮發率相應增加，18 d時的累積揮發率分別為5.2%、4.0%和7.0%。本研究中，白腐真菌對萘、菲、芘的吸附率和降解率均已排除其揮發率的影響。

圖1 萘、菲、芘的揮發特征Figure 1 The volatility of naphthalene，phenanthrene and pyrene

2.1.2 白腐真菌對萘、菲、芘的吸附特征

作為污染物生物修復的主要過程之一，生物吸附在PAHs的去除中起著重要作用[9]。如圖2所示，白腐真菌對3種PAHs的吸附能力表現出相同的變化趨勢。當萘的初始濃度為30 mg·L-1時，滅活菌和活菌對萘的吸附率均在第4 d時達到最大值，分別為29.3%和17.7%。以往的研究也表明，白腐真菌對萘的吸附率在20%左右[18]。白腐真菌對菲和芘的吸附也是在第4 d時達到最大值，其吸附率分別為18.7%和47.2%（活菌），以及38.2%和70.6%（滅活菌）。丁潔等[19]的研究表明，白腐真菌活菌在第3 d時對菲和芘的生物吸附率分別為19.7%和52.2%。而侯樹宇等[20]的研究中，白腐真菌活菌對芘的最大吸附率僅為14.4%。以往的研究表明，分配作用是白腐真菌對PAHs生物吸附的主要機制，且分配作用的大小與PAHs的分配系數呈正相關[21]。

吸附動力學特征表明（表1），白腐真菌滅活菌體和活菌對萘、菲、芘吸附的偽一級動力學擬合相關系數R2均在0.88以上，表明白腐真菌對這3種PAHs的吸附過程符合偽一級動力學模型。白腐真菌滅活菌體對萘、菲、芘的平衡吸附量分別為2.207 3、0.103 1 mg·g-1和 0.016 9 mg·g-1，顯著高于活菌的平衡吸附量。本研究發現，白腐真菌滅活菌體和活菌對3種PAHs的平衡吸附量依次為萘＞菲＞芘。相反，小麥根系對它們的親和力由大到小依次為芘、菲、萘[22]。由此可見，不同的吸附材料對PAHs的吸附能力不同。

圖2 白腐真菌對萘、菲、芘的吸附特性Figure 2 The biosorption of white rot fungion naphthalene，phenanthrene and pyrene

表1 白腐真菌吸附PAHs的動力學參數Table 1 Kinetic parameters of adsorption of PAHs by white rot fungi

由圖2和表1可知，當萘、菲、芘的初始濃度分別為30、1 mg·L-1和0.1 mg·L-1時，滅活的白腐真菌對萘、菲、芘的吸附性能高于活菌的吸附性能。以往的研究也表明，白腐真菌滅活菌對萘、菲、芘的吸附性高于活菌的吸附性[9，21]。分析認為，一方面菌體在經過高壓滅活以后會改變其原有的蛋白質結構，通透性變好，使得菌體對污染物的吸附性能增強[21]；另一方面，滅活真菌的吸附作用主要是細胞壁表面的快速吸附，而活菌的吸附作用還可能與微生物的代謝活動、對污染物的趨避行為、對環境的應激反應等因素有關，與生物降解、生物積累和礦化等作用密不可分的關系導致活菌吸附率偏低[9，21]。

2.2 白腐真菌對萘、菲、芘的降解特性

白腐真菌活菌對PAHs的去除是在吸附和降解的共同作用下完成的[9]。由圖3可知，在第1 d，只有少量萘被白腐真菌降解，其降解率為3.5%，而白腐真菌對萘的吸附率卻達到了6%。隨著培養時間延長至第4 d，萘的累計去除率達到了29.1%（其中降解率為11.4%，而吸附率為17.7%）。當培養至第7 d時，萘的降解率達到了23.1%，而吸附率卻比第4 d時減少了11.3%。隨著培養時間的不斷延長，萘的降解率持續增加，而吸附率表現出相反的變化趨勢。在第18 d時，白腐真菌對萘的總去除率達到了46.9%，其中降解率為36.3%，吸附率為10.6%。由此可見，培養初期（第1～4 d），白腐真菌在對萘的去除過程中吸附作用占據主導地位，其貢獻率在60%以上。隨后白腐真菌對萘的吸附能力逐漸降低并最終穩定在10.6%左右。相反，白腐真菌對萘的降解率逐漸提高，在培養18 d后，白腐真菌對萘的降解率達到了36.3%，占總去除率的77.3%。

圖3 白腐真菌對萘、菲、芘的降解特性Figure 3 The degradation of white rot fungion naphthalene，phenanthrene and pyrene

與萘的降解特性相似，菲的降解率隨著培養時間的延長而逐漸增加（圖3）。在第1～4 d時，生物吸附是白腐真菌去除菲的主要途徑，其吸附率比同一時間的降解率高出14.7%～91.2%。隨后，生物降解成為白腐真菌去除菲的主要途徑，對菲的去除貢獻率為62.3%～71.2%。盡管白腐真菌對芘的累計降解率也隨培養時間的延長而逐步提高，但吸附作用始終是白腐真菌去除芘的主要過程，而生物降解對芘去除的貢獻率僅為15.5%～40.5%。丁潔等[21]的研究也發現，白腐真菌對菲和芘的生物降解作用隨著培養時間的延長而逐漸增大。這可能是由于白腐真菌對PAHs的吸附由分配作用主導，且吸附-脫附過程是可逆的，隨著培養液中PAHs總量的減少，吸附在菌體上的PAHs可能脫附出來而發生降解[9]。因此，培養后期生物吸附作用逐漸減少而生物降解作用逐漸增強。經過18 d的連續培養后，在生物吸附和生物降解的共同作用下，白腐真菌對菲和芘的總去除率分別達到了53.5%和73.7%。Acevedo等[23]的研究發現，白腐真菌對土壤菲和芘的去除率分別為62.0%和60%。侯樹宇等[20]的研究表明，白腐真菌（P.chrysosporium）單獨培養可去除59.5%的芘；當與細菌共培養時，去除率高達99.5%。相反，也有研究表明，白腐真菌（Pseudotrametes gibbosa）在18 d時對芘的去除率僅為28.3%[24]。另外，本研究表明，在培養后期，降解率與吸附率的比值從大到小依次為萘＞菲＞芘。其中的主要原因是分子量的增加使得其水溶性下降，脂溶性提高更容易被吸附，而分子量的增大也使得其生物學毒性增強，抑制了白腐真菌的代謝活性[25]。

2.3 Tween 80對多環芳烴去除的影響

表面活性劑具有固定的親水親油基團，在溶液的表面能夠定向排列，并且具有增溶、分散、乳化或破乳、降低界面張力的作用[26-27]。由表2可知，Tween 80強化了白腐真菌對萘、菲、芘的去除能力。在對照條件下，白腐真菌對萘、菲、芘的去除率分別為48.1%、55.0%、74.1%。白腐真菌對萘和菲的去除率隨Tween 80濃度的增加而增加。Tween 80濃度為1.0 g·L-1時，白腐真菌對萘和菲的去除率分別比對照提高了33.5%和40.0%。白腐真菌對芘的去除能力隨著Tween 80濃度的增加而呈現先增加后降低的趨勢。在Tween 80濃度為0.6 g·L-1條件下，白腐真菌對芘的去除率達到了最大值（88.5%），比對照提高了19.4%。陳靜等[26]的研究發現，當Tween 80為2 mg·L-1時，土壤中PAHs的去除率比對照提高了3.5倍。Hickey等[28]通過添加0.5 g·L-1的Tween 80，使熒蒽的降解率從62.4%提高到79.6%。而Wong等[29]發現，添加3 mol·L-1的Tween 80會嚴重抑制菲的降解。這是由于高濃度表面活性劑產生了毒性，抑制了白腐真菌的活性，從而降低了PAHs的降解率[26]。

漆酶是白腐真菌降解PAHs的關鍵酶之一。在降解PAHs的過程中，漆酶氧化PAHs產生相應的醌類物質[14]。如表2所示，漆酶活性與PAHs的去除率成正比。在對照條件下，白腐真菌的漆酶活性為121.2 U·L-1。隨著Tween 80濃度的增加，白腐真菌漆酶活性不斷提高，并在Tween 80濃度為1.0 g·L-1時達到最大值，為310.3 U·L-1。除了能提高白腐真菌的漆酶活性外，Tween 80還使其生物量提高了0.24～1.55倍，白腐真菌數量的增加可以提高其對PAHs的生物吸附和生物降解作用。陳靜等[26]的研究也表明，Tween 80可以顯著提高白腐真菌的生長速率。另外，有研究表明，Tween 80可以提高PAHs在溶液中的溶解度，從而提高它們的去除率[29]。

2.4 Cu2+對多環芳烴去除的影響

Cu2+是一種常見的重金屬離子，它的存在對PAHs的生物吸附和生物降解有一定的調控作用[21]。因此，本研究也考察了不同濃度Cu2+對白腐真菌降解萘、菲、芘及相應漆酶活性的影響。如表3所示，低濃度 Cu2+（0.01 mmol·L-1）對白腐真菌的生長沒有明顯影響，但是當Cu2+濃度≥0.05 mmol·L-1時，白腐真菌的生長受到明顯抑制，且隨著Cu2+濃度的增加，抑制作用不斷增強。這與以往的研究結果一致[21]。在Cu2+濃度為5.0 mmol·L-1條件下，白腐真菌的生物量比對照減少了45.1%。盡管當Cu2+濃度≤1.25 mmol·L-1，白腐真菌的生長受到一定程度的抑制，然而漆酶活性卻比對照提高了76%～172%。作為漆酶的輔助因子，Cu2+不僅可以誘導漆酶的產生，同時也可以提高它的活性[8]。何峰[14]的研究發現，當 Cu2+濃度為 1 mmol·L-1時，白腐真菌（Ganoderma sp.En3）的漆酶活性比對照提高了3.83倍。Yang等[30]發現，當Cu2+濃度為0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1時，白腐真菌（Trametes velutina）的漆酶活性顯著高于對照，且漆酶基因的轉錄水平分別是對照組的6.3倍和9.5倍。

由表 3可知，當 Cu2+濃度從 0.01 mmol·L-1提高至5.0 mmol·L-1時，白腐真菌對萘、菲、芘的去除率均呈現先增加后降低的趨勢。在Cu2+濃度為0.25 mmol·L-1條件下，白腐真菌對萘、菲、芘的去除率達到最大值，分別為85.3%、88.5%和91.3%，比對照提高了23.2%～77.3%（P＜0.05）。當Cu2+濃度繼續提高時，白腐真菌對萘、菲、芘的去除率逐漸下降。在Cu2+濃度為5.0 mmol·L-1條件下，白腐真菌對萘、菲、芘的去除率受到抑制，低于對照組。已有研究表明，低濃度Cu2+（≤1.25 mmol·L-1）不僅能提高白腐真菌對 PAHs的吸附作用，同時也可以提高它的降解能力；而高濃度Cu2+在白腐真菌上累積后會產生毒性作用，降低白腐真菌對PAHs的轉化率[19]。例如，丁潔等[21]的研究發現，當 Cu2+濃度在 0.01～0.5 mmol·L-1時，白腐真菌對菲的吸附率隨Cu2+濃度的增大而增強，且當Cu2+濃度≤1.25 mmol·L-1時，白腐真菌對菲和芘的降解率也明顯高于對照。Ting等[8]的研究也證實，1 mmol·L-1Cu2+使白腐真菌（G.lucidum）對菲和芘的去除率分別比對照提高了37%和81%，相應地，漆酶活性提高了7.5%。Cu2+強化PAHs的吸附作用主要是通過提高PAHs在白腐真菌上的分配系數，以及PAHs和Cu2+-π的形成實現的[19]。而Cu2+強化白腐真菌對PAHs的生物降解作用主要通過提高漆酶活性來實現。

表2 不同濃度Tween 80條件下PAHs的去除率和漆酶活性Table 2 The removal of PAHs and laccase activity under different concentration of Tween 80

表3 Cu2+對PAHs的去除率和漆酶活性的影響Table 3 The effects of Cu2+on removal of PAHs and laccase activity

3 結論

（1）在萘、菲、芘的初始濃度分別為30、1、0.1 mg·L-1和35℃條件下，白腐真菌滅活菌對其的最大吸附率分別為29.3%、38.2%和70.6%，而活菌的最大吸附率分別為17.7%、18.7%和47.2%。

（2）白腐真菌對PAHs的去除是在吸附和降解的共同作用下完成的。經過18 d的培養后，萘、菲、芘的去除率分別達到了46.9%、53.5%和73.7%。

（3）Tween 80提高了白腐真菌的生物量和漆酶活性，進而提高了PAHs的去除率；當Tween 80濃度為1.0 g·L-1時，白腐真菌對萘和菲的去除率達到最大值，分別比對照提高了33.5%和40.0%，而菲的去除率在Tween 80濃度為0.6 g·L-1時達到最大值。

（4）低濃度 Cu2+（≤0.25mmol·L-1）可提高漆酶活性，進而強化白腐真菌對萘、菲、芘的去除能力；而當Cu2+≥1.25 mmol·L-1時，漆酶活性顯著降低，導致萘、菲、芘的去除率急劇下降。