miR-622在上皮性卵巢癌組織的表達差異及其機制

袁冠華 鄭銳年

廣東省南方醫科大學附屬東莞市人民醫院1 婦產科，2 腫瘤內科（廣東東莞523000）

卵巢癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，據統計，約90%的卵巢癌為上皮性卵巢癌[1]。由于卵巢組織較為隱蔽，早期并沒有明顯的癥狀，多數患者確診時已經為晚期，而且卵巢癌具有侵襲轉移能力強、復發率高、易產生耐藥性等特點，預后效果較差，病死率高[2]。microRNA是在真核生物細胞體內廣泛存在的高度保守短鏈RNA，由22～23個核苷酸組成，通過靶向結合目標靶基因mRNA的3′-UTR 區，在轉錄后水平抑制靶基因表達，具有調節細胞分化、增殖以及凋亡的分子功能[3-4]。近年來，多項研究表明，microRNA 與人類多種惡性腫瘤的發生、發展進程以及患者預后密切相關[5-6]。miR-622 作為近年來新發現的與腫瘤相關microRNA家族重要成員之一，在結直腸癌[7-8]、胃癌[9]、腎癌[10]、甲狀腺癌[11]、膽管癌[12]、卵巢癌等[13-15]多種惡性腫瘤組織或細胞均具有異常表達，且參與了腫瘤細胞的惡性演進等過程。然而，miR-622 參與卵巢癌細胞的發生、發展進程等生物分子機制鮮有報道。本研究主要探究miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白在卵巢癌組織的表達情況，通過體外細胞轉染技術研究miR-622與KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白的調控關系，旨在探究miR-622 參與卵巢癌細胞的發生、惡化進展的作用機制，為卵巢癌機制研究及基因治療提供資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料連續選取我院于2018年度經確診為卵巢上皮性癌患者共80例，卵巢上皮性良性瘤40例，正常卵巢組織30例，每位患者都簽署知情同意書。卵巢上皮性癌選人標準：初次手術，之前未接受放化療，術后經病理學確診為上皮性卵巢癌患者。排除標準：合并其他嚴重疾病者，如免疫性疾病患者、嚴重精神病患者、確診為其他惡性腫瘤患者等。卵巢上皮性良性瘤患者年齡（52.5± 6.5）歲，其中黏液性腺瘤18例，漿液性腺瘤22例。正常卵巢組織患者年齡（57.8 ± 7.3）歲，均取自卵巢切除且病理確診無異常患者。

1.2 方法

1.2.1 提取和檢測RNARNA 提取與檢測按照TRIZOL 試劑盒說明書方法提取組織總RNA，并采用紫外分光光度計檢測提取RNA的濃度與純度，以A280/A260 作為合格標準。應用miRcute miRNA 第一鏈合成試劑盒對提取的總RNA 逆轉錄成cRNA，采用miRcute miRNA qPCR 試劑盒進行PCR產物擴增。miR-622 上游引物以及內參U6 上游引物分別購自于北京優寧康生物公司以及北京嘉美紐諾生物公司。PCR 反應參數：預變性95℃15 min，變性95℃20 s，退火60℃30 s，72℃延伸10 s，共擴增40個循環，采用2-ΔΔCT方法計算miR-622 相對表達量。

1.2.2 測量KRAS蛋白、MAPK1蛋白以及p-ERK蛋白的相對表達水平免疫組化實驗應用免疫組化SP 法測量組織樣品的KRAS蛋白、MAPK1蛋白以及p-ERK蛋白的相對表達水平。所有樣品都用10%的中性福爾馬林液進行固定，用石蠟包埋后作成4 μm的連續切片，并進行防脫處理，后嚴格按照SP 法進行檢測。參照Prugger 等方法，根據細胞染色比例，制定評分標準[16]：0 分為0～1%陽性細胞、1 分為1%～10%陽性細胞、2 分為10%～50%陽性細胞、3 分為50%～75%陽性細胞、4 分為75%～100%陽性細胞。根據細胞染色強度，制定評分標準：0為未染色細胞、1 分為淡黃色細胞、2 分為棕黃色細胞、3 分為棕褐色細胞。最后將兩種評分兩兩相加計算最后總分，得分范圍為0～7 分。

1.2.3 細胞培養與轉染細胞培養與轉染人卵巢癌SKOV3細胞株來自于中國科學院細胞庫，加入1640 培養基+10%胎牛血清，置于培養箱，培養箱環境設置條件為恒溫37℃、5%CO2以及95%空氣。應用脂質體（Lipofectami-neTM3000）作為載體分別將miR-622 模擬物（miR-622 上調組）、陰性對照物轉染至SKOV3細胞株（miR-622 下調組），僅以脂質體試劑轉染作為空白對照組（miR-622對照組）

1.2.4 Western Blot實驗細胞轉染培養Western Blot實驗細胞轉染培養48 h后，用蛋白裂解液（PIPA）對細胞進行裂解并分別提取3 組細胞的總蛋白，用Bradford 法測定細胞蛋白濃度，蛋白質樣品經過水浴變性后進行SDS-PAGE 電泳分離，后轉至PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶對PVDF 膜封閉1～2 h，分別加入KRAS、MAPK1 以及p-ERK 一抗以及適量封閉液，放置4℃冰箱過夜。加入二抗，室溫下孵育2 h，在暗室采用ECL 化學發光發檢測，壓片顯影。顯示結果于X 光片，掃描圖片，并計算結果。

1.3 統計學方法采用SPSS 24.0 統計軟件進行分析統計，計量資料采用表示，比較兩者之間差異采用t檢驗方法，比較三者之間差異采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MiR-622以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在3 組組織的表達3 組組織的miR-622表達以及多種蛋白表達差異均具有統計學意義（P＜0.05），卵巢癌組織中的miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白均明顯高于正常卵巢組織以及良性瘤組織（P＜0.05），而良性瘤組織與正常卵巢組織差異沒有統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 MiR-622 與KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在卵巢癌組織表達與相關關系卵巢癌組織中的miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK 蛋 白表 達水平與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤病理類型無關（P＞0.05），FIGO 處于Ⅲ-Ⅳ期以及發生淋巴結轉移時，miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達水平升高（P＜0.05），此外，KRAS蛋白在中低分化以及黏液性卵巢癌呈高表達（P＜0.05）。見表2。

表1 miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在不同組織的表達Tab.1 The expression of miR-622，KRAS，MAPK1，p-ERK in different issure±s

表1 miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在不同組織的表達Tab.1 The expression of miR-622，KRAS，MAPK1，p-ERK in different issure±s

注：與正常卵巢組織對比，*P ＜0.05

指標正常卵巢組織良性瘤組織卵巢癌組織F 值P 值例數30 40 80 miR-622 相對表達2.02±0.22 2.05±0.21 2.45±0.41* 60.33＜0.001 KRAS蛋白/分1.67±0.49 1.75±0.51 3.89±1.12* 126.81＜0.001 MAPK1蛋白/分1.62±0.45 1.64±0.49 4.05±1.58* 62.77＜0.001 p-ERK蛋白/分1.17±0.22 1.21±0.24 3.08±1.19* 104.93＜0.001

表2 miR-622 與KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白和卵巢癌臨床病理參數的關系Tab.2 The relationship between miR-622 and KRAS，MAPK1，p-ERK，pathological parameters of ovarian cancer±s

表2 miR-622 與KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白和卵巢癌臨床病理參數的關系Tab.2 The relationship between miR-622 and KRAS，MAPK1，p-ERK，pathological parameters of ovarian cancer±s

注：*P ＜0.05

FIGO 分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期病理類型漿液性腺癌黏液性腺癌分化程度高分化中低分化淋巴結轉移否是28 52 59 21 29 51 45 35 2.01±0.15 2.89±0.49* 2.40±0.30 2.50±0.34 2.38±0.31 2.52±0.33 2.28±0.23 2.62±0.41* 3.52±0.89 4.26±1.15* 3.59±0.91 4.19±1.13* 3.48±0.86 4.30±1.18* 3.51±0.89 4.27±1.15* MAPK1蛋白/分4.01±1.50 4.09±1.54 4.11±1.56 3.99±1.48 3.68±1.22 4.42±1.82* 4.01±1.35 4.09±1.69 3.99±1.45 4.11±1.59 3.61±1.32 4.49±1.72* p-ERK蛋白/分3.01±1.00 3.15±1.16 3.18±1.21 2.98±0.95 2.78±0.82 3.38±1.34* 3.04±0.95 3.12±1.21 3.01±0.91 3.15±1.25 2.58±0.73 3.58±1.43*

2.3 MiR-622 調控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達Western Blot檢測結果顯示，3組樣本的miR-622 以及多種蛋白相對表達量差異均具有統計學意義（P＜0.05），與miR-622對照組相比，miR-622上調組中的KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達水平明顯增加（P＜0.05），而miR-622 下調組中的KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白水平表達明顯減少（P＜0.05）。見表3、圖1。

表3 miR-622 調控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達Tab.3 The expression of KRAS、MAPK1、p-ERK controlled by miR-622±s

表3 miR-622 調控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達Tab.3 The expression of KRAS、MAPK1、p-ERK controlled by miR-622±s

注：*P ＜0.05

指標miR-622對照組miR-622下調組miR-622上調組F值P值miR-622相對表達2.68±0.51 0.23±0.09* 12.55±1.12* 1 161.85＜0.001 KRAS蛋白0.53±0.05 0.24±0.03* 0.78±0.11* 248.20＜0.001 MAPK1蛋白0.62±0.08 0.31±0.03* 0.94±0.13* 111.42＜0.001 p-ERK蛋白0.59±0.05 0.15±0.01* 0.89±0.12* 372.60＜0.001

3 討論

圖1 miR-622 調控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達Fig.1 The expression of KRAS、MAPK1、p-ERK controlled by miR-622

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，目前發病機制尚未完全清楚，據統計研究，晚期患者 5年生存率不到30%[17-18]。由于缺乏早期有效的篩查方法，大多數病人在確診后都已到晚期，癌細胞已廣泛轉移。因此，卵巢癌早期的診斷以及治療方法是當前探索的當務之急。近年，microRNAs是各個領域研究的重點方向之一，microRNA是在真核生物細胞體內廣泛存在的高度保守短鏈RNA，由22～23個核苷酸組成，通過靶向結合目標靶基因mRNA的3′-UTR 區，在轉錄后水平抑制靶基因表達，具有調節細胞分化、增殖以及凋亡的分子功能。miR-622 作為近年來新發現的與腫瘤相關microRNA 家族重要成員之一，并且在多種惡性腫瘤有廣泛的研究報道[19]。然而，miR-622在卵巢癌的國內外研究報道較少。至于miR-622是如何參與卵巢癌細胞的發生、惡性演進等鮮有研究報道。

在本研究中，結果顯示miR-622在卵巢上皮性癌組織中的表達水平高于卵巢良性上皮性腫瘤組織和正常卵巢組織，miR-622在卵巢癌組織的表達與患者年齡、腫瘤大小、病理類型以及分化程度無關，僅與FIGO 分期以及是否淋巴結轉移有關，FIGO處于Ⅲ～Ⅳ期miR-622表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，發生淋巴結轉移miR-622表達明顯高于未轉移狀態，這可能與miR-622 上調能夠促進卵巢細胞侵襲和轉移能力有關。研究還發現KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白在卵巢癌組織表達水平高于良性腫瘤組織和正常組織，FIGO 處于Ⅲ～Ⅳ期以及發生淋巴結轉移時，KRAS、MAPK1、p-ERK 三種蛋白表達明顯高于相應的FIGO 處于Ⅰ～Ⅱ期以及未發生淋巴結轉移狀態，此外還發現KRAS蛋白在中低分化以及黏液性卵巢癌呈高表達。KRAS在卵巢癌組織呈高表達，這與KURMAN 等[20]報道的KRAS基因突變在卵巢癌中較常見，多見于低分化，低FIGO 分期和黏液性組織類型一致，突變后的KRAS蛋白處于持續激活狀態。MAPK1 與p-ERK蛋白在卵巢癌組織呈高表達可能與MAPK/ERK信號通路被激活有關。實驗結果顯示KRAS、MAPK1、p-ERK 三種蛋白可能都參與了卵巢癌惡化演進過程[21-22]。

MAPK/ERK信號通路是真核細胞普遍存在的信號通路，主要負責連接細胞外刺激到細胞內基因表達的通道。據統計，1/3 人類腫瘤發生與該通路的突變或激活密切相關，MAPK/ERK信號通路的激活可以引起腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的惡性演進。本實驗結果顯示，通過調節SKOV3細胞miR-622表達升高，可以調控細胞MAPK1、p-ERK蛋白表達升高，可能與MAPK/ERK信號通路的激活有關，具體機理有待下一步探究。研究還發現卵巢癌組織中的miR-622表達水平也明顯高于正常或良性瘤組織，而且miR-622能夠調控MAPK1以及p-ERK蛋白的表達，顯示miR-622 與卵巢癌的發生密切相關。KRAS 基因突變在卵巢癌中較常見，KRAS 作為卵巢癌靶向基因之一，與卵巢癌的發生與惡性演進密切相關。研究結果表明調節SKOV3細胞miR-622表達升高，能夠調控KRAS 基因蛋白表達的上升，進一步驗證miR-622 與卵巢癌發生與惡性演進相關。張志方等[13]研究表明調節細胞miR-622 上升能夠促進癌細胞遷移和侵襲能力，與本文研究結果一致。

綜上所述，miR-622在上皮性卵巢癌組織中呈高表達，能夠調控卵巢癌細胞中KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白的表達，并且參與卵巢癌的發生以及惡性演進。