鈣穩態在神經退行性疾病中的研究進展

郭成玉 羅果

遵義醫科大學醫學與生物學研究中心（貴州遵義563000）

鈣在人體內大部分以結合鈣的形式存在于骨骼和牙齒中，極小部分以游離鈣的形式存在，即鈣離子。鈣離子在細胞生理功能中發揮著十分重要的作用[1]，如在神經元中可作為第二信使[2]，調控神經突觸的功能。神經退行性疾病的主要特征是中樞神經系統和周圍神經系統中神經元的退化與死亡，常見的神經退行性疾病主要包括帕金森病（Parkinson′s disease，PD）、阿爾茲海默病（Alzheimer′s disease，AD）、亨廷頓舞蹈病（Huntington′s disease，HD）、肌萎縮性脊髓側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、不同類型脊髓小腦共濟失調、Pick 病等[3]。盡管這些神經退行性疾病有著各自不同的發病機制和特征，但據研究表明鈣穩態在疾病的進程中均起到了至關重要的作用，從鈣穩態的角度研究神經退行性疾病的發生發展已成為國內外研究的重點和熱點。

1 Ca2+ 在細胞內外的分布

鈣離子是真核細胞中重要的第二信使[2]，調節廣泛的生理功能，包括細胞生長、細胞凋亡、分化、代謝、肌肉收縮、神經元可塑性和基因轉錄[4]。鈣離子的濃度在2.1～2.6 mmol/L 之間變化[5]，在細胞內外及不同細胞器中的分布極不均一。靜息狀態時細胞質中鈣離子的濃度為0.1 μmol/L 左右相對于人體內結合鈣的濃度要低約10 000倍[6]，與細胞外相差4個數量級，線粒體和內質網中鈣離子濃度比細胞質中高出數倍。當細胞受到刺激，鈣離子從細胞外進入或從鈣庫中釋放，以增加細胞質中鈣濃度；靜息時，鈣庫聚鈣，降低細胞質中鈣水平，以適應細胞機能。細胞質中的鈣離子雖然只占細胞總鈣的極少部分，卻調節著細胞的各種功能，若鈣離子濃度發生異常，則會導致細胞損傷甚至凋亡的發生。

2 細胞內鈣穩態的調節機制

細胞內鈣穩態的調節是一個復雜的生理過程，主要依靠細胞膜、內質網、線粒體等對鈣離子的轉運和濃度進行調節。

2.1 細胞外鈣內流在可興奮細胞（如神經細胞、肌細胞、腺細胞）中，細胞外鈣離子主要是通過電壓門控鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCC）內流[7]。VGCC 有助于許多關鍵的生理功能，包括細胞興奮性、肌肉收縮、神經遞質釋放和基因表達等[8]，VGCC 根據組織和藥理特性分為五種：L型、P/Q型、N型、R型和T型。其中主要的VGCC有：L型鈣通道（long-lasting calcium channel），該通道廣泛存在于各種細胞中，是細胞興奮過程中鈣離子內流的主要途徑。T型鈣通道（transient calcium channel）主要存在于心肌、神經元及血管平滑肌細胞中，已被證明參與腫瘤抑制基因[9]，同時參與細胞增殖、激素分泌、心臟起搏等。N型鈣通道（neuronal calcium channel）僅存在于神經組織中，突觸前鈣離子內流主要通過N型VGCC 介導并觸發神經遞質的釋放[10]。VGCC的活性受諸如通道磷酸化、通道與G蛋白或化合物（如二氫吡啶類）結合等因素調節，通過增加細胞外鉀離子濃度使細胞膜去極化而開放VGCC[11]。

2.2 細胞內貯存鈣的釋放細胞內鈣主要貯存于內質網和線粒體中，對胞質內鈣離子濃度的調節有重要作用。內質網釋放鈣離子主要通過內質網膜上的三磷酸肌醇受體（IP3R）[12]和ryanodine受體（RyR）這兩種鈣通道進行[13]。線粒體是細胞內最重要的鈣庫之一，可以通過鈉離子依賴的鈣離子釋放（mNCX）、鈉離子非依賴的鈣離子釋放（NICE）、DAG 激活的陽離子通道（DAG-activated cation-selective channel，DCC）和線粒體通透性轉變孔道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）[14]等途徑介導的鈣離子釋放。

2.3 鈣泵與鈉鈣交換體細胞主要通過鈣泵與鈉鈣交換體降低細胞質中鈣離子的濃度。鈣泵是一種跨膜轉運蛋白，屬于鈣離子激活的ATP 酶，利用ATP 水解釋放的能量將鈣離子從細胞質轉運到細胞外或泵到肌質網內。鈉鈣交換體是細胞膜上的逆向轉運系統，利用膜兩側的鈉離子濃度梯度勢能將細胞內的鈣離子排出細胞，以維持細胞內低的鈣離子濃度。在某些病理條件下反向鈉鈣交換體會被激活，從而造成細胞內鈣超載。

3 鈣穩態在神經退行性疾病中的研究

神經元對鈣離子水平極其敏感，鈣離子參與其多種重要的生理活動，鈣穩態失衡會引起神經細胞功能出現異常，甚至導致神經元退化和死亡，因而鈣穩態在神經退行性疾病的研究中受到越來越多的關注。

3.1 PD 中的鈣穩態研究PD是最常見的與年齡相關的神經退行性疾病之一。PD 主要定義為運動障礙，典型癥狀為靜息震顫、僵硬、運動遲緩和姿勢不穩，同時普遍存在認知障礙，在疾病后期常表現為癡呆癥[15]。PD的發病機制十分復雜，其主要病理特征是中腦黑質致密部多巴胺（dopamine，DA）能神經元變性缺失和紋狀體DA 含量顯著減少。

越來越多的證據表明，鈣離子濃度升高在多巴胺能神經元變異中起重要作用。黑質致密部的多巴胺能神經元中鈣離子通過位于質膜上的鈣通道和轉運蛋白進入細胞，或從線粒體和內質網釋放增加胞內鈣離子濃度，升高的鈣離子會刺激激鈣蛋白酶，從而參與突觸核蛋白的加工和多巴胺能神經元變性進而引起帕金森病。多巴胺能神經元中鈣離子濃度還可通過Ca2+-ATP 酶、鈉鈣交換體（NCX）、線粒體-鈣離子單向轉運體MCU 調節，或經由內質網-線粒體途徑釋放[16]。這些通路通過對鈣離子濃度的調節參與了黑質致密部的多巴胺能神經元變性和PD的疾病進程，內質網通過調控鈣離子的釋放從而影響多巴胺能神經元的存活狀態，而mPTP 則誘導神經元線粒體和內質網應激。另有研究表明溶酶體可通過膜上的Ca2+/H+交換器參與調節細胞內鈣離子濃度進一步引起PD。細胞內鈣離子濃度經由各個途徑升高后不僅引起多巴胺神經元變性推動疾病進程，同時會引起細胞凋亡。細胞凋亡在多巴胺能神經元的損傷過程中同樣占有非常重要的地位。

SINGH 等[17]將神經毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）注入小鼠的紋狀體后，小鼠出現運動過緩、肌強直、靜止性震顫等行為學異常，而用尼莫地平處理后能顯著減輕小鼠的行為學異常。研究表明皮下注射伊拉地平可保護PD動物模型中的黑質致密部神經元。BEZPROZVANNY[18]通過回顧性研究發現，用鈣離子通道拮抗劑治療高血壓可顯著降低PD的發生風險，這也支持了鈣通道拮抗劑對PD的保護作用。綜上所述細胞鈣穩態異常是PD 發生、發展的重要原因之一，有效地調控鈣穩態可能成為預防PD 發生和控制疾病進程的新方案。

3.2 AD 中的鈣穩態研究AD是一種神經退行性腦病，疾病的早期可出現輕微的記憶困難，逐漸演變為認知障礙[19]和癡呆癥，并出現適應行為受損等臨床表現的中樞神經系統疾病[20]，其主要病理特征為腦區出現神經元死亡和病理性損害。

近年的研究表明，細胞鈣穩態異常引起AD神經元死亡是發生發展的重要原因之一。曾經“淀粉樣蛋白級聯假說”[21]被認為是AD 發病的主要機制，但大量針對性研究和臨床藥物試驗并未取得良好的治療效果。ALZHEIMER'S ASSOCIATION CALCIUM HYPOTHESIS WORKGROUP[22]推測細胞內鈣穩態失調是AD 神經變性的主要原因之一。隨后大量證據表明，鈣離子在AD 神經元變性死亡中起重要作用。在AD 神經元內質網中鈣離子濃度升高，引起鈣信號傳導代償性改變，進而影響鈣依賴性鈣調神經磷酸酶（CaN）、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）[23]與鈣離子之間的平衡。這些鈣離子信號異常最終導致神經突觸功能喪失和神經元變性。而異常的鈣離子信號使長效增強（LTP）和長效抑制（LTD）突觸機制之間保持平衡被打破，突觸功能被LTD 機制削弱，導致記憶喪失[24]。因此，針對突觸鈣信號通路的研究為AD 藥物治療的開發提供了機會。N-甲基-D-天冬氨酸受體NMDAR（該蛋白在突觸后膜去極化時被去除，從而允許鈣離子流入神經元）在興奮性突觸神經傳遞中發揮重要作用，NMDAR的持續激活可導致鈣超載從而導致線粒體膜去極化、自由基產生和細胞的死亡[25]。在疾病的早期，NMDAR 被過度激活從而對神經細胞產生損傷，而在疾病晚期，NMDAR 過度激活與認知缺陷有關。另外β-淀粉樣蛋白（Aβ）也可引起NMDAR表達和活性失調，破壞的NMDAR信號傳導途徑進一步導致突觸功能受損[26]。SIMONA 等[27]研究發現AD 患者的海馬和前額中紅藻氨酸類谷氨酸受體上調，這種上調伴隨著NMDAR和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑-丙酸酯（AMPA）受體的下調。NMDAR和AMPA受體已被證明是介導學習、記憶和認知的基本分子機制，其受損可能是AD 患者發生認知功能障礙的主要原因。

大量實驗證明恢復鈣穩態可能成為治療AD的新途徑。目前非競爭性NMDAR 抑制劑Memantine和NR2B 特異性拮抗劑EVT-101 已被美國FDA 批準用于AD 治療，L型VGCC 抑制劑MEM-1003 已經進入AD 臨床Ⅱ期試驗中。因此細胞內鈣穩態的恢復是治療AD的新手段之一，細胞內的鈣通道、鈣泵和線粒體鈣系統等也很有可能成為治療AD的新靶點[18]。

3.3 HD 中的鈣穩態研究HD是由亨廷頓蛋白（HTT）氨基末端的多聚谷氨酰胺擴增引起的常染色體顯性遺傳性神經變性疾病，其主要癥狀為進行性運動功能障礙、認知能力下降和精神障礙[28]。

HD 中紋狀體的中型多刺神經元（MSN）和皮質中的錐體神經元選擇性死亡可能與突觸傳遞改變[29]、腦源性神經營養因子減少[30]、線粒體功能障礙[31]和鈣穩態失衡等因素有關。SILVA 等[32]研究表明突變的HTT蛋白通過與N型鈣通道及其結合蛋白相互作用調節該鈣通道，而N型鈣通道在HD小鼠皮層神經元突觸前膜鈣離子內流和突觸小泡釋放增多中起重要作用。突變的HTT通過調節N型電壓門控的鈣通道使谷氨酸釋放增加，谷氨酸能過度激活與認知缺陷有關。而阻斷N型鈣通道消除了HD 轉基因小鼠模型BACHD 小鼠中的谷氨酸的釋放使其降低到野生型小鼠的水平。該實驗證明阻斷鈣通道可以更好的改善由突變HTT 引起的認知障礙。CHEN 等[33]從HD 小鼠模型zQ175 獲得原代皮層神經元，發現與野生型相比，zQ175 皮層神經元突觸小泡的釋放和突觸前膜鈣離子內流增加，加入BAPTA（鈣離子螯合劑）處理后可明顯降低神經遞和鈣離子內流。MIRANDA 等[34]用鈣通道拮抗劑處理神經元后，發現神經細胞的病死率明顯降低，證明了鈣通道拮抗劑具有神經保護作用。同時MIRANDA 等在BACHD 小鼠模型的研究中發現，BACHD 小鼠的紋狀體神經元與野生型相比對谷氨酸損傷更敏感，表現出更高的細胞死亡水平。伊拉地平可以阻斷谷氨酸的興奮毒性，使細胞病死率降低至正常水平，該實驗表明鈣通道阻斷劑也可有效地保護表達突變HTT的神經元。丁苯那嗪（TBZ）是一種有效的囊泡單胺轉運蛋白抑制劑，臨床用于亨廷頓舞蹈病治療。研究表明TBZ可減少HD 患者的舞蹈病癥狀并保護紋狀體神經元免于變異，其神經保護作用可能是通過降低細胞內鈣離子濃度來實現[18]。

3.4 ALS 中的鈣穩態研究ALS是由于運動神經元死亡引起的致命性神經退行性疾病，累及神經、肌肉、骨骼、腸道等多系統。臨床表現為肌無力和萎縮、延髓麻痹及錐體束征，最終會因呼吸衰竭而導致死亡，通常是在出現癥狀后3～5年[35]。ALS 絕大多數為散發，約5%～10%的病例表現為常染色體顯性遺傳，稱為家族性ALS，其中20%的患者為超氧化物歧化酶1（SOD1）基因變異。以SOD1G93A突變基因研究最為廣泛[36]。

ALS 主要表現為運動神經元丟失和骨骼肌萎縮，鈣離子不僅參與神經信號的傳遞和肌肉的收縮，而且參與細胞內線粒體功能的調節和ROS的生成，線粒體鈣信號失調與過量ROS 產生之間形成惡性循環可能會加劇ALS 疾病進程中的肌肉萎縮[37]。JAISWAL[38]研究發現舌下運動神經元（HMNs）中的鈣離子濃度隨Na-疊氮化物/氰化物的刺激而增加，并且在WT和SOD1G93A小鼠以及SOD1的細胞培養模型中存在差異。利魯唑可以適度抑制興奮毒性誘導的線粒體內鈣信號傳導，從而保護ALS 疾病小鼠模型中神經元細胞，Jaiswal 評估了利魯唑和褪黑激素調節的鈣離子內流和鈣離子釋放的影響。同時還發現與單用Na+-疊氮化物相比，當合用Na+-疊氮化物與利魯唑時，SOD1G93A和WT 小鼠中鈣離子的峰值幅度抑制非常顯著，這種現象可能是由于線粒體復合物IV 受到抑制和通過VDCC 進入胞內的鈣離子減少導致的。該研究結果進一步支持了利魯唑改善興奮性毒性和鈣信號傳導的假設，并且可能在ALS 中線粒體介導的細胞代謝等多種功能中起作用[39]。

近年來在ALS的疾病研究中，非神經細胞的缺陷逐漸成為研究的熱點。CHEN 等[40]評估了ALS 轉基因小鼠模型SOD1G93A中骨骼肌興奮-收縮（EC）偶聯和細胞內鈣離子濃度的變化。結果發現在發病前靜息肌細胞內鈣離子濃度即開始增加，這種增加與鈣離子清除/緩沖蛋白的減少有關，表明ALS 小鼠在疾病進程中細胞的鈣穩態發生改變，并且鈣離子升高可能導致ALS 小鼠的肌肉無力。另有研究表明ALS 模型小鼠肌細胞的線粒體病變區域總是與失控的鈣離子釋放相關聯，原因可能是去極化的線粒體減少對鈣離子的攝取，從而導致鈣濃度升高，失控的鈣釋放可能加劇了肌肉的萎縮[41]。KARAM 等[42]等研究發現在失神經的骨骼肌細胞內，是由于線粒體對鈣離子攝取功能的喪失導致了細胞無法產生生理性的鈣離子瞬變，這可能是失神經骨骼肌細胞產生ROS 從而導致肌肉萎縮的初始原因。以上研究表明，鈣穩態的異常可能直接導致運動神經元的退化和骨骼肌的萎縮，從恢復細胞鈣穩態的角度來研究ALS可能是預防和治療該疾病新的有效途徑。

4 總結與展望

細胞內鈣穩態的調節是一個復雜的生理過程，主要依靠細胞膜、內質網、線粒體等對鈣離子的轉運和濃度進行調節。內質網和線粒體是細胞內最重要的儲鈣細胞器，通過釋放鈣離子維持細胞內鈣濃度。鈣離子的平衡在神經元細胞中起著特別重要的作用，它介導多個重要的生理過程，并在控制突觸可塑性中起核心作用，鈣離子異常增多會造成線粒體損傷、神經元變性并導致疾病的發生發展。大量研究表明，PD、AD、HD和ALS 等神經退行性疾病的主要病理特征是神經元的退化和死亡，細胞內鈣穩態異常會導致線粒體功能障礙和突觸功能喪失，破壞細胞內穩態，是引起神經元退化的重要原因之一。綜上所述，在神經退行性疾病中深入研究鈣離子的調控機制及相關鈣通道在疾病進程中的作用，將為治療該類疾病提供新的靶點，探索如何恢復鈣穩態將是預防和治療神經退行性疾病的潛在策略。