血清生長停滯特異性蛋白6c.834+7G＞A單核苷酸多態性與重度子癇前期風險增加的相關性

劉力 張敬蕊 張含 侯曉琳 李瑤 羅茜茜

石家莊市第四醫院1檢驗科，2 產科（石家莊050000）

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是妊娠期特有的疾病[1]，發生在妊娠期20周之后，病情的嚴重程度可呈持續性進展，主要表現為妊娠期出現高血壓并發蛋白尿，病情嚴重時可致多個臟器損傷，嚴重威脅母嬰健康[2-3]。子癇前期患者出現血壓持續升高、蛋白尿、血清肌酐升高、血小板降低、微血管病性溶血、血清轉氨酶水平升高、持續頭痛或其它大腦或視覺障礙、持續上腹部疼痛等任一不良情況可診斷為重度子癇前期（severe pre-eclampsia，SPE）[4]。

子癇前期一個重要的病理過程包括子宮螺旋動脈重鑄障礙，缺血缺氧，釋放多種胎盤因子進入母體血液循環，引起血管內皮細胞受損并激活系統性炎癥[5]。其中，胎盤高表達生長停滯特異性蛋 白6（growth arrest-specific protein 6，GAS6）[6]。GAS6是三個受體酪氨酸激酶TAM（Tyro-3/Axl/Mer）的配體，在無生長刺激時，抑制細胞凋亡，屬維生素K 依賴蛋白家族[7]。研究證實GAS6 廣泛存在于多種組織和細胞中，如生殖細胞、神經細胞、淋巴細胞等，也可在人血清或血漿中檢測到[8]，GAS6 與血管的穩態、炎癥反應、代謝紊亂和免疫調節密切相關[9]。8個GAS6 單核苷酸多態性已被證實[10]，并且發現中風與GAS6內含子8 中c.834+7G ＞A 密切有關[11]。GAS6 c.834＋7G ＞A位點中AA 基因型和等位基因A在腦梗死、腦出血及急性心肌梗死的病例組中的頻率顯著低于對照組，提示c.834＋7G ＞A位點AA基因型和A等位基因心絞痛、不穩定心絞痛以及急性心肌缺血患者中具有保護效應[12-13]。2015年的一項基于土耳其人的研究證實，c.834+7G/A位點的多態性與子癇前期之間存在關聯[14]。而2017年的另外一項研究表明，中國人群c.834+7G/A位點的多態性在子癇前期病例組和對照組間沒有明顯差別[15]。

然而GAS6內含子c.834+7G/A位點的多態性是否在中國人群的重度子癇前期患者中有不同基因型的分布，國內外無報道。因此本研究選取重度子癇前期患者作為研究對象，將明確GAS6 單核苷酸多態性是否參與重度子癇前期發病機制，可以預警病情發展并為基因水平治療干預提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料本文為病例對照研究，選取2016年到2018年在我院住院的重度子癇前期患者（SPE組）213例，年齡18～40歲；納入標準：以人民衛生出版社第9 版《婦產科學》對子癇前期的診斷標準為判定依據：孕20周后出現收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg，伴有尿蛋白≥0.3 g/24 h或隨機尿蛋白定性≥（+）。伴有下面任何一種表現即診斷重度子癇前期：（1）收縮壓≥160 mmHg和（或）舒張壓≥110 mmHg；（2）肝酶異常：血清轉氨酶水平升高于2倍正常值以上；（3）腎功能受損：血肌酐濃度高于2倍正常值以上；（4）血小板計數持續性下降，低于100 × 109/L；（5）肺水腫；（6）神經系統異常。排除標準：（1）患者孕前患有高血壓、心臟病、甲狀腺疾病、腎臟疾病以及糖尿病等內科疾病；（2）雙胎；（3）有復發性流產病史。對照組為正常妊娠臨產婦女350例。本研究得到我院倫理委員會的批準（20190007）。

1.2 方法

1.2.1 血清提取及普通風險指標檢測入組孕晚期孕婦清晨空腹采集靜脈血，EDTA 抗凝血和促凝血各4 mL，EDTA 抗凝血用于對孕婦GAS6的c.834+7 G ＞A位點進行基因分型，促凝血待血液凝固后3 500 r/min 離心15 min，所得血清保存在-80℃冰箱待用。全自動生化分析儀Backman AU5800測定谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、肌酐（CREA）和尿蛋白。Wofen TOP 700測定D-D二聚體（D-Dimer）。血小板計數（PLT）由Mindray BC6800評估。

1.2.2 DNA提取及GAS6 c.834+7G ＞A基因分型按照QIAamp DNA blood kit（Qiagen，Germany）說明書從外周血淋巴細胞中提取基因組DNA，并保存至-80℃冰箱待用。采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）對GAS6內含子c.834+7G ＞A進行基因分型，過程簡述如下：以外周血基因組DNA為模板，擴增引物序列為：5′-TTCCCTCAAGAAAGAGCCCG-3′和5′-TCTCATCCCAAACCTCCACA-3′，經PCR擴增產生大小為481 bp的產物。擴增在MyCycler 熱循環儀系統（Bio-Rad，United States）中進行，條件如下：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延長7 min。用限制性內切酶Hha I 消化擴增產物。消化后PCR 產物在3%瓊脂糖凝膠上電泳并用溴化乙錠染色，在紫外光下拍攝凝膠圖片并記錄。根據DNA 片段大小及分布，可對GAS6 c.834+7G ＞A位點進行基因分型。基因分型依據為：有兩個條帶，大小分別為345 bp和136 bp，其基因型為AA型；有3個條帶，大小分別為481 bp、345 bp和136 bp，其基因型為AG型；僅有一個條帶，大小為481 bp，其基因型為GG。

1.3 統計學方法計量資料均以均數±標準差表示。應用Levene檢驗對數據進行正態性分布及方差齊性檢驗。配對t檢驗和方差分析用于比較病例組和對照組之間計量資料的差異。檢驗對照組人群各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，以判斷所選人群是否存在基因型或等位基因的分布偏差，從而確定其對整體人群的代表性。χ2檢驗用于決定Hardy-Weiberg 平衡下的基因型分布，對比對照組與患者間等位基因和基因型頻數差別。采用非條件Logistic 回歸模型計算比值比（OR）及95%置信區間（95%CI）。用SPSS 22.0 統計軟件進行數據統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SPE病例對照組普通風險指標差異明顯兩組間普通風險指標差異見表1。對年齡、孕周等指標做計量資料單因素分析結果顯示所有指標呈正態分布且方差齊性，其中SPE病例組生產時的孕周、血小板計數顯著低于對照組（P＜0.05），收縮壓、舒張壓、血肌酐、尿蛋白和D-Dimer 顯著高于對照組（P＜0.05）。

表1 病例組和對照組普通風險指標差異Tab.1 Common risk parameters in SPE and control groups±s

表1 病例組和對照組普通風險指標差異Tab.1 Common risk parameters in SPE and control groups±s

注：*P ＜0.05

風險指標年齡（歲）孕周體質量指數（kg/m2 ）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）尿蛋白（g/24 h）PLT（109 /L）CREA（μmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）D-Dimer（ng/L）SPE 組（n=213）28.9±4.4 34.1±3.2* 24.3±4.5 161±17* 104±13* 2.9±1.1* 187±63* 99±45.6* 20.4±9.1 23.3±8.7 4.7±1.1* 對照組（n=350）28.2±4.7 37.6±2.3 25.1±3.6 116±13 78±13 0.08±0.03 297±60 57.6±21.3 13.7±5.6 16.2±6.1 2.2±0.9

圖1 GAS6 c.834+7G ＞A位點三種基因型頻率Fig.1 Genotype frequencies of GAS6 c.834+7G ＞A

2.2 SPE病例對照組各基因型及等位基因分布差異明顯PCR 產物經限制性內切酶處理后，GAS6 c.834+7G ＞A位點3 種基因型電泳結果如圖1A，按照PCR 產物經酶處理后電泳結果將所有受試者進行基因分型。經過基因分型發現（圖1B），GAS6 c.834+7G ＞A的基因型AA、AG和GG在350例對照組人群中則分別是27.4%（96/350）、52.6%（184/350）和20.0%（70/350），在213例SPE 患者中的表達分別是20.6%（44/213）、28.2%（60/213）和51.2%（109/213）。其中基因型AA和AG 從對照組到SPE組有明顯下降趨勢（圖1B）。SPE組等位基因A和G頻率分別為34.9%（149/426）和65.1%（277/426）；對照組中分別為53.7%（376/700）和46.3%（324/700）。等位基因A和G進行χ2檢驗（表2），發現其在SPE 組和對照組之間存在差異（χ2= 37.364，P＜0.05）。將基因型進行χ2檢驗發現，其在SPE組與對照組間差異有統計學意義（χ2= 61.109，P＜0.05）。由于基因型分為3型，將其進行兩兩比較發現（表2），基因型AA和AG在SPE 組與對照組間差異無統計學意義（χ2= 2.107，P= 0.147），AA和GG在SPE 組與對照組間差異有統計學意義（χ2=27.327，P＜0.05），AG和GG在PE 組與對照組間差異有統計學意義（χ2= 56.724，P＜0.05），AA和AG+GG在PE 組與對照組間差異無統計學意義（χ2= 3.250，P= 0.071），AG和AA+GG在SPE 組與對照組間有顯著意義（χ2=32.110，P＜0.05），GG和AA+AG在SPE 組與對照組間差異有統計學意義（χ2=59.340，P＜0.05）。

2.3 等位基因G和基因型GG可能與重度子癇前期風險增加有關從表3可以看出，SPE 組GAS6 c.834+7G ＞A位點等位基因G 頻率（0.651）高于對照組（0.463）（P＜0.05），SPE 組GAS6 c.834+7G ＞A位點基因型GG 頻率（0.512）明顯高于對照組（0.200）（P＜0.05），提示等位基因G及基因型GG可能為風險因素。

3 討論

表2 3 種基因型兩兩比較結果Tab.2 Comparative analysis among three genotypes例

表3 SPE 組和對照組基因型和等位基因頻率Tab.3 Genotype and allele frequencies in SPE and control groups例（%）

經χ2檢驗，健康對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P= 0.749）。單因素分析后重點考慮基因型的影響，利用Logistic 線性回歸分析結果發現，如果選取AA為比對參考（表3），則AG、GG及AG+GG的OR（95%CI）分別為0.711（0.449～1.128）、3.397（2.131～5.416）和1.452（0.967～2.180）。如果選取AG為比對參考（表3），則AA、GG及AA+GG的OR（95%CI）分別為：1.406（0.887～2.228）、4.775（3.143～7.256）和2.827（1.962～4.071）。等位基因Logistic 分析發現，如果選取A為比對參考，則G的OR（95%CI）為2.157（1.683～2.766）。

統計分析結果表明（表3），SPE 組等位基因G及GG 基因型頻率明顯高于對照組（GG：0.512vs.0.200；G：0.651vs.0.463），提示等位基因G及基因型GG為風險因素。

為了明確GAS6 c.834+7G ＞A的單核苷酸多態性（SNP）與重度子癇前期（SPE）風險增加的相關性，本研究按照病例對照實驗方法對受試者GAS6 c.834+7G ＞A進行了基因分型。結果顯示（表3），基因型AA、AG和GG在213名SPE 患者中的頻率排布為AA ＜AG ＜GG，基因型GG 占大部分（51.2%，表2），350名對照者三種基因型的頻率為GG ＜AA ＜AG，基因型AG 占優勢（52.6%）。可以看出，SPE 組基因型等位基因向G 偏移，多為純合型GG（占51.2%），對照組基因型等位基因向A 偏移，多為雜合型AG（占52.6%），提示等位基因G及基因型GG為風險因素。

越來越多的研究表明GAS6-Axl 系統參與維持內皮細胞穩態、調節細胞存活、增殖、遷移、粘附和吞噬[9，16-17]。臨床數據表明子癇前期具有家族傾向性，但遺傳方式尚不明確[18]。GAS6 基因存在至少8個單核苷酸多肽位點[10，19]，有學者研究結果發現，2型糖尿病組GAS6 c.834+7G/A位點的A 等位基因頻率低于正常對照組[20-21]，而有研究發現，急性冠狀動脈綜合征患者GAS位點的AA 基因型和A 等位基因檢出率低于對照組[12]。又鑒于GAS在血管內皮損傷中發揮著重要作用，所以該位點的單核苷酸多態性可能與子癇前期的臨床表現相關[22]。OZAKPINAR 等的研究證實，834+7G/A位點的多態性與子癇前期之間存在關聯，基因位點A可能有保護作用[14]。而YE 等[15]的一項研究表明，834+7G/A位點的多態性在子癇前期病例組和對照組間沒有明顯差別，而是另一個位點834+1332C/T 與PE 風險相關。本實驗結果顯示，SPE病例組GG 基因型是最常見的，SPE 組GAS6 c.834+7G ＞A位點基因型GG 頻率（0.512）明顯高于對照組（0.200）（P＜0.05）；且相對于AA 基因型，GG 基因型患病的風險提高約3.4倍（OR= 3.397，95%CI：2.131～5.416），完全落入OZAKPINAR 等[14]的OR95%置信區間（OR= 3.508，95%CI：1.352～9.102）內；基因型AA和AG 頻率也明顯低于對照組。相比于基因型AG，基因型AA和GG 患病的風險分別提高約1.4倍（OR= 1.406，95%CI：0.887～2.228）和4.8倍（OR= 4.775，95%CI：3.143～7.256），提 示GAS6 c.834+7G/A位點的基因型GG和SPE的風險增加有關，即GG 基因型為風險指標。SPE 組GAS6 c.834+7G ＞A位點等位基因G 頻率（0.651）高于對照組（0.463）（P＜0.05），且與等位基因A 比較，等位基因G 患病的風險提高2.2倍（OR= 2.157，95%CI：1.683～2.766），同樣落入OZAKPINAR 等[14]的OR95%CI（OR= 2.118，95%CI：1.330～3.371），提示GAS6 c.834+7G/A位點的等位基因G和SPE的風險增加有關，即等位基因G 具有風險指標。進一步分析OZAKPINAR 等[14]的其他數據可以得出相似的結論，因此本實驗河北省育齡婦女的研究結果和OZAKPINAR 等的結果一致。綜上所述，GAS6 c.834+7G ＞A 等位基因G和基因型GG 與重度子癇前期的風險增加有關。

重度子癇前期臨床表現包括患者血壓升高，肝臟腎臟功能損害，肺水腫，神經系統異常等，具體實驗室指標包括：蛋白尿、血肌酐，血小板計數、轉氨酶等[2，23]。本研究也比較了病例對照組中上述風險指標，發現雖然大多數（如孕周、血小板計數、收縮壓、舒張壓、血肌酐、尿蛋白和D-Dimer 等）差異明顯，但其中一些指標即使在病例組也與正常值參考范圍有重疊。這個現象提示風險指標預警可能并不絕對，且都是出現重度子癇前期病癥后表現出的風險指標預警。而GAS6 c.834+7G ＞A基因型可以在疾病發生之前進行預警，將高危孕婦納入重點保護范圍，為可能的疾病發生提供及早及時的防治策略。

YE等[15]基于四川人群的研究表明，GAS6 c.834+7G ＞A位點的多態性在子癇前期（包括中度及重度）病例組和對照組間沒有明顯差別。分析YE等[15]對照組發現GAS6 c.834+7G ＞A位點的等位進A 基因頻率（0.26）遠遠低于OZAKPINAR 等[14]統計的正常土耳其人及本研究結果中A 基因頻率（0.54），提示人群的遺傳異質性可能會影響結果。而本研究基于本地區育齡婦女亦有可能有遺傳異質性，期待更大規模納入中國各個不同地區的回顧性分析解決這一問題。

綜上，基于河北省育齡婦女的研究證明GAS6 c.834+7G ＞A的多態性與重度子癇前期風險增加有關，且等位基因G和基因型GG可能是重度子癇前期的風險因素，GAS6 c.834+7G ＞A的多態性基因分型可用于重度子癇前期的預后預斷。