氨肽酶P2在結直腸癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

曾瑤 徐惠麗 王夢漪 張子龍

1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院腫瘤科（武漢430014）；2 華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院（荊州434020）

結直腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤[1-3]，在我國的發病率和死亡率均高居所有惡性腫瘤的第5位，嚴重威脅國民的生命健康[4-5]。結直腸癌的發生發展是一個多因素參與的多步驟復雜過程，其中，原癌基因的激活和抑癌基因的表達失調扮演著重要的角色[6-10]。XPNPEP2（也稱為氨肽酶P2 或APP2）作為一種膜結合金屬蛋白酶，由位于Xq25 染色體上的人XPNPEP2 基因編碼，可催化去除氨基酸序列中脯氨酸N 端P1位點的氨基酸殘基，如Arg-Pro-Pro 等[11-14]。既往關于XPNPEP2生物學功能的研究主要集中在心血管疾病方面，其可參與血管舒張劑緩激肽的代謝過程[13]及ACEI 藥物引起的血管性水腫[14]。最近研究發現，XPNPEP2在惡性腫瘤的發生發展中也發揮著重要作用。相關研究表明，XPNPEP2在宮頸癌[15]、前列腺癌[16]及胃癌[17]中異常表達，且其高表達與腫瘤的侵襲轉移及患者不良預后密切相關[15，17]。然而，關于XPNPEP2在結直腸癌中的表達情況及其臨床預后價值尚未見報道。在前期，我們通過GEPIA在線數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析發現，XPNPEP2在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于正常組織，因此推測XPNPEP2的表達異常可能也參與了結直腸癌的惡性進展。基于此，本研究擬利用免疫組織化學方法對113例結直腸癌組織及配對癌旁組織中XPNPEP2蛋白的表達情況進行檢測，并分析其表達水平與患者臨床病理特征及預后的關系，以探究其在結直腸癌發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇于2014年1月至2015年6月在華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院和華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院接受手術治療、并符合下述納入與排除標準的113例結直腸癌患者為研究對象。納入標準為：經病理學明確診斷為結直腸癌；術前未進行任何抗腫瘤治療；接受規范性的結直腸癌根治手術；患者臨床病理信息和隨訪資料完整。排除標準為：術前已轉移、接受姑息性切除的患者；排除5年內有其他惡性腫瘤既往史者。術后病理分期采用國際抗癌協會（UICC）第7 版腫瘤分期系統。結直腸癌及對應癌旁組織樣本經手術切除后迅速進行多點取材，經4%甲醛溶液固定并石蠟包埋保存備用。本研究獲得華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院和附屬荊州醫院倫理委員會批準，知情同意書已于標本收集時簽署。

1.2 免疫組化染色組織石蠟標本制作成4 μm切片，免疫組化染色按試劑盒說明書進行。主要步驟包括：石蠟切片置于恒溫箱中烘烤脫蠟，再置于二甲苯中脫蠟2次，酒精梯度水化、抗原修復、內源性過氧化物酶阻斷和山羊血清室溫封閉后，加入兔抗人XPNPEP2 一抗（1∶200，美國Abcam公司）4℃孵育過夜；次日滴加標記有HRP的二抗（山羊抗兔二抗，武漢賽維爾生物科技有限公司），室溫孵育30 min，顯色劑（DAB）顯色，顯微鏡下控制反應時間。蘇木精行細胞核復染，乙醇水化及二甲苯透明，中性樹膠封片，在奧林巴斯光學顯微鏡下進行閱片和結果判定。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組化結果評分采用雙盲法由2名具有豐富經驗的實驗員對免疫組化結果進行閱片并評分。XPNPEP2 陽性結果為細胞出現棕黃色至深褐色。結果判定分別根據染色強度及陽性細胞百分率進行。染色強度：0 分（陰性），1 分（弱陽性，淺黃色），2 分（中等陽性，棕黃色），3 分（強陽性，褐色）；陽性細胞百分比：0 分（≤5%），1 分（6%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%），4 分（≥76%）。兩項評分的乘積為最終的評分，總分范圍0～12 分，≤6 分定義為低表達，＞6 分定義為高表達。

1.4 臨床資料收集及隨訪通過查閱患者病歷檔案，收集患者臨床病理信息，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、脈管浸潤及TNM 分期等。采用電話隨訪或門診復診等方式自手術當日起進行隨訪，隨訪截止時間為2018年12月31日，隨訪時間42～60個月，中位隨訪時間52個月。記錄患者的無復發生存期（recurrence-free survival，RFS）和總生存期（overall survival，OS）。RFS：確診之日至局部復發或遠處轉移或最后1次隨訪日期；OS：確診之日至患者死亡或最后1次隨訪日期。

1.5 統計學方法采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier 生存函數計算無復發生存率及總生存率并繪制生存曲線，組間生存差異比較采用Log-rank檢驗。采用單因素分析探究影響無復發生存率和總生存率的危險因素，有顯著意義的風險因子（P＜0.05）納入Cox 比例風險模型進行多因素分析，探究影響患者預后的獨立危險因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 XPNPEP2蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達水平如圖1A 所示，XPNPEP2表達主要定位于細胞膜和細胞質，在結直腸癌組織和癌旁組織中均有表達，在癌組織中的表達強度高于癌旁組織。免疫組化評分顯示，XPNPEP2在結直腸癌組織中的表達評分顯著高于癌旁組織（t= 17.02，P＜0.001），見圖1B。進一步根據腫瘤的TNM 分期分層分析顯示，XPNPEP2在結直腸癌組織中的表達水平隨著分期升高而升高，差異具有統計學意義（均P＜0.01），見圖1C。

圖1 XPNPEP2在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達Fig.1 Expression of XPNPEP in colorectal cancer and adjacent normal tissues

2.2 XPNPEP2蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數的關系根據上述判斷標準，XPNPEP2在69例結直腸癌組織中高表達，高表達率為61.06%（69/113）。進一步分析發現，結直腸癌組織中XPNPEP2 高表達與腫瘤浸潤深度、脈管浸潤及TNM 分期顯著相關（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度及淋巴結轉移均無明顯統計學相關性（均P＞0.05），見表1。

2.3 XPNPEP2蛋白表達與結直腸癌患者預后的關系在113例結直腸癌患者中，XPNPEP2 高表達患者69例，無復發生存率為50.7%，總生存率40.6%；低表達患者44例，無復發生存率為72.7%，總生存率70.5%。Kaplan-Meier 生存分析顯示，XPNPEP2蛋白高表達組患者的無復發生存率和總生存率均顯著低于低表達組，差異具有統計學意義（χ2= 8.531，P= 0.003；χ2= 11.751，P= 0.001），見圖2A和2B。

單因素分析顯示，腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、脈管浸潤、TNM 分期及XPNPEP2表達水平是影響結直腸癌患者無復發生存率和總生存率的危險因素（均P＜0.05），見表2；將單因素分析中差異具有統計學意義（P＜0.05）的指標納入多因素Cox比例風險模型多因素分析表明，TNM 分期及XPNPEP2表達水平是影響患者無復發生存率（HR：2.99，95%CI：1.49～8.16，P= 0.003；HR：1.66，95%CI：1.19～2.96，P= 0.015）和總生存率（HR：5.01，95%CI：1.49～16.82，P= 0.009；HR：1.75，95%CI：1.24～3.57，P=0.023）的獨立危險因素，見表3。

3 討論

XPNPEP2蛋白作為一種廣泛存在于原核生物和真核生物中的氨基酰基脯氨酸水解酶，由XPNPEP2 基因編碼，主要表達于人體的腎、肝和肺的內皮細胞和上皮細胞表面[11]。在既往的研究中，主要關注了XPNPEP2在心血管疾病中的功能[13-14]，很少探討關其在惡性腫瘤中的作用。到目前為止，僅局限于宮頸癌、前列腺癌和胃癌中，但扮演的角色卻不盡相同[15-17]。在本研究中，我們通過分析113例結直腸癌組織中XPNPEP2蛋白的表達水平及其與患者臨床病理學特征和預后的相關性，證實了XPNPEP2在結直腸癌組織中表達顯著上調，且其高表達與腫瘤浸潤深度、脈管浸潤、TNM 分期及患者不良預后顯著相關。進一步的單因素和多因素分析提示，XPNPEP2 高表達是影響患者無復發生存期和總生存期的獨立預后因素。上述研究結果表明，XPNPEP2在結直腸癌中扮演著促癌基因的角色，這與其在胃癌和宮頸癌中的作用相似[15，17]。

表1 XPNPEP2在結直腸癌中的表達與臨床病理特征的關系Tab.1 The relationship between XPNPEP2 expression and clinicopathological characteristics in colorectal cancer

表2 影響結直腸癌患者預后的單因素分析Tab.2 Univariate analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

表3 影響結直腸癌患者預后的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

目前，關于XPNPEP2 影響惡性腫瘤發生發展的具體機制，研究仍較為有限。CHENG 等[15]首先報道了XPNPEP2在宮頸癌中的表達及功能，研究者通過一系列體外、體內實驗結合臨床樣本分析，發現XPNPEP2在宮頸癌組織中表達顯著上調，且其高表達與淋巴結轉移和更晚的FIGO 分期有關，生存分析表明XPNPEP2 高表達患者的總生存期顯著縮短。進一步的機制研究證實，XPNPEP2可通過誘導宮頸癌細胞的EMT 進程，增強其侵襲和遷移能力，進而介導宮頸癌的進展與轉移。最近，LI 等[16]通過高密度多器官腫瘤組織陣列芯片分析XPNPEP2在人體腫瘤標本中的表達譜，結果顯示XPNPEP2在正常前列腺組織中適度表達，而在前列腺癌中顯著降低；進一步，研究者使用TCGA數據庫，IHC和ELISA驗證了XPNPEP2在前列腺癌患者組織和血清中的表達水平，發現XPNPEP2在前列腺癌組織中的表達水平顯著低于正常前列腺組織，但在局部晚期和淋巴結轉移的前列腺癌組織中的表達水平較早期前列腺癌更高，聯合使用PSA和XPNPEP2可提高對患者淋巴結轉移的預測準確性。王偉等[17]的研究發現，XPNPEP2蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，其高表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、脈管浸潤及TNM 分期均無明顯相關性；生存分析表明XPNPEP2 高表達的胃癌患者生存率顯著低于低表達者，而COX多因素分析顯示XPNPEP2 不是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。上述研究結果提示，XPNPEP2在惡性腫瘤中的表達和作用可能具有癌種特異性，不同腫瘤中XPNPEP2的表達水平、臨床意義及分子功能不盡相同。

本研究通過臨床樣本檢測分析，首次證實了XPNPEP2在結直腸癌組織中表達上調，并與多種不良臨床病理學特征及患者的不良預后密切相關。然而，本研究僅局限于臨床樣本分析，未在細胞及動物水平對XPNPEP2 介導結直腸癌發生發展的分子機制進行進一步的探索和驗證；同時，本研究納入的臨床樣本來源于兩中心，且數量僅為113例，可能使得某些分析結果出現偏移。盡管如此，本研究的結果為進一步探究XPNPEP2在結直腸癌中的分子功能及潛在機制奠定了一定基礎。在未來，我們一方面將收集更多臨床樣本對本研究結果進行進一步驗證；同時也將開展體外及體內實驗，對XPNPEP2 促進結直腸癌的潛在分子機制進行探究。

綜上所述，本研究結果表明XPNPEP2在結直腸癌組織中表達顯著上調，其高表達與多種不良臨床病理特征及患者的不良預后密切相關，可作為評估結直腸癌患者預后的潛在生物標志物。