三葉木通愈傷誘導及分化研究

賈明良，方荷芳，李同建，文鋒，韓興杰，金洪光，徐玲玲，廖亮

(九江學院藥學與生命科學學院，江西 九江 332000)

三葉木通[Akebiatrifoliate(Thunb.) Koidz.]為木通科(Lardizabalaceae)木通屬(AkebiaDecne.)藤本植物，以其藤莖入藥，具有利尿通淋、清心除煩、通經下乳功效[1]。此外，三葉木通作為一種新型水果資源也逐漸受到重視，其果肉清甜可口，可鮮食，具有很高的營養價值[2]，進一步深加工可制作果汁[3]、果酒[4]、果茶[5]、果脯[6]等產品。三葉木通種質資源的開發利用已有報道，如利用野生資源進行馴化及進一步人工栽培[7-8]。對不同種質資源的繁殖方式也有研究，如利用種子進行播種繁殖[9]，利用枝條進行扦插繁殖[10-13]等。種子繁殖容易產生性狀分離，扦插繁殖系數相對較低且不利于進一步的品系改良，因此，有學者進行了三葉木通的植物組織培養研究，如沈國林等[14]比較了不同外植體、培養基、pH、溫度、光照、植物生長物質種類及其配比等對三葉木通愈傷組織誘導的影響；劉香[15]研究發現，適當的超聲波處理可促進三葉木通愈傷組織的誘導；黎世齡等[16]則對三葉木通胚乳進行了愈傷組織的誘導研究。以上研究均集中在愈傷組織的誘導上，并未進一步誘導產生胚狀體或叢生芽。除了愈傷組織誘導以外，蘇慧慧等[17]以下胚軸為外植體誘導愈傷，進一步研究了愈傷組織的再分化及褐化抑制；石小兵等[18]以種子為外植體誘導產生不定芽，然后再利用秋水仙素進行染色體加倍得到多倍體。以上研究雖得到了叢生芽，但外植體類型為下胚軸或是種子，來源受到季節的限制。本文利用來源廣泛的幼嫩枝條及葉片為外植體，對三葉木通無菌外植體獲得、愈傷誘導以及胚狀體誘導等過程進行了研究，同時分析了愈傷組織褐化的主要影響因素，以期建立三葉木通組織培養體系，為三葉木通優良品系擴繁及進一步的品系改良和遺傳轉化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料來自江西省九江市九江學院木通種質資源圃栽培基地，以選育的三葉木通優良品系幼嫩莖段、葉片為外植體，莖段選取尚未木質化的幼嫩枝條，葉片則選用剛展開的幼嫩葉片，取材時間避開連續陰雨天，選擇晴朗的上午，取材后將材料置于采樣袋內，噴水保濕，盡快帶回實驗室進行下一步試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1無菌外植體獲取及接種前浸泡對褐化的影響 采用幼嫩的莖段及葉片為外植體，流水沖洗后，在超凈工作臺中用75%酒精消毒1 min，然后無菌水沖洗3次，再利用0.1%的氯化汞水溶液(升汞)進行滅菌處理，處理時間梯度設置為3、5、8、12、15 min，隨后無菌水沖洗5次以洗凈升汞殘留，置于無菌瓶中待用。

將滅菌后的幼嫩莖段切割為長度0.5 cm左右，葉片則切割為0.5 cm2大小進行接種，接種至培養基MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1中，每瓶接種5個外植體，每個處理接種6瓶，于培養室中培養20 d后，記錄污染率、褐化率等生長情況。培養條件為：光照強度 1 500～2 000 lx，每天光照時間為12 h，溫度(25±1)℃。

選擇合適的滅菌處理，先將切割后的莖段及葉片在無菌水中浸泡3 min，再接種到培養基上，考察浸泡處理對褐化的影響。

1.2.2外植體愈傷組織誘導 表面滅菌處理后的幼嫩莖段切割為0.5 cm左右長，葉片切割為0.5 cm2大小，接種至添加不同濃度的2,4-D(0.2、0.4、1.0 mg·L-1)和NAA(1.0、2.0、4.0 mg·L-1)的MS培養基中，以不加激素的MS培養基為對照。每瓶接種5個外植體，每個處理接種6瓶，于培養室中培養20 d后，記錄愈傷組織的誘導率、褐化率等生長情況。培養條件為：光照強度1 500～2 000 lx，每天光照時間12 h，溫度(25±1)℃。

1.2.3培養方式對外植體誘導愈傷組織時褐化的抑制效果 以褐化嚴重的幼嫩莖段為外植體，考察固體培養、液體培養兩種培養方式，分別添加不同濃度活性炭(activated carbon，AC)，在見光、避光兩種培養條件下對外植體誘導愈傷組織時褐化的抑制效果進行研究。固體培養添加瓊脂6.0 g·L-1，液體則不添加瓊脂；AC濃度設定為0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 g·L-1。見光培養時光照強度 1 500～2 000 lx，每天光照時間12 h，避光培養除遮蔽光照外其余同光照培養。每瓶接種5個外植體，每個處理接種6瓶，培養20 d后，記錄愈傷組織誘導率、褐化率等數據。

1.2.4愈傷組織再分化誘導胚狀體 將已誘導出來的愈傷組織，接種至添加不同濃度的6-BA(0.2、0.4、1.0 mg·L-1)和NAA(1.0、2.0、4.0 mg·L-1)的MS培養基中培養60 d，觀察記錄胚狀體誘導率及褐化率等數據。培養條件為：光照強度1 500～2 000 lx，每天光照時間12 h，溫度(25±1)℃。

1.3 數據處理

采用Excel 2007、SPSS 18.0統計軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 外植體處理方式對愈傷組織誘導和褐化的影響

2.1.1適宜外植體的表面滅菌處理方法 對幼嫩莖段及葉片滅菌處理后接種培養，污染和褐化情況見表1。由表1可以看出，隨著升汞滅菌時間的延長，莖段和葉片外植體的污染率均逐漸降低，而褐化率則由于升汞的毒害而逐漸升高。對比莖段和葉片外植體，在相同的滅菌強度下，葉片外植體的污染率和褐化率均較低。因此，葉片為三葉木通愈傷組織誘導時優先選用的外植體。綜合考慮污染和褐化的情況，莖段和葉片合適的滅菌處理組合為：75%乙醇消毒1 min，然后升汞滅菌12 min，并用無菌水沖洗干凈升汞殘留后接種。此時雖然污染率不是最低，但是褐化情況較低，為合適的滅菌組合。

表1 滅菌條件對無菌外植體獲取的影響Table 1 Effect of sterilization conditions on the acquisition of sterile explants

2.1.2浸泡處理對愈傷組織褐化的抑制效果 接種前進行浸泡處理對褐化的影響結果如表2所示。可以看出，同一滅菌處理下，不管是莖段還是葉片，接種前通過浸泡處理3 min后，均可降低褐化情況的產生。在浸泡后，可發現無菌水由無色透明變為茶色。

表2 接種前浸泡處理對外植體褐化的影響Table 2 Effect of immersion treatment before inoculation on the browning of explants

2.2 莖段及葉片外植體的愈傷組織誘導

不同激素配比下，莖段及葉片愈傷組織的誘導情況如表3所示。從表3可以看出，在不添加任何激素的A1培養基中，莖段和葉片均無愈傷組織產生。莖段愈傷的誘導在A7培養基內可以達到92.00%的誘導率，顯著高于其他培養基。因此，選取A7為莖段愈傷組織的適宜誘導培養基，即為MS+NAA 0.4 mg·L-1+2,4-D 4.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。葉片愈傷誘導在A9培養基內誘導率最高，達到97.53%，應為葉片誘導愈傷組織的適宜培養基：MS+NAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。此外，在A5及A6培養基上的愈傷組織誘導率也分別達到了94.43%和91.00%，也可作為備選培養基類型。

表3 不同激素配比對莖段及葉片愈傷誘導的影響Table 3 Effect of different hormone combinations on callus induction with stem and leaf

2.3 不同處理對外植體誘導愈傷時褐化的抑制效果

兩種培養方式對外植體誘導愈傷時褐化的抑制效果見表4。固體培養條件下，見光及避光培養時，活性炭(AC)濃度的變化對愈傷的誘導有一定的影響。AC濃度在0～1.0 g·L-1時，愈傷誘導率雖有差異，但都在80%以上。以褐化率為標準，在見光培養時，AC濃度在1.0 g·L-1時最低，為7.33%；而避光培養時，在AC濃度在1.0 g·L-1時最低，為7.00%。橫向比較見光及避光條件下的褐化情況，可以看出，在相同條件下，避光培養可以在一定程度上降低褐化的發生。由表4可以看出，液體培養時，不管是見光還是避光，不論在何種AC濃度情況下均不能誘導愈傷組織，所有的外植體均逐漸死亡。可見，液體培養不適合三葉木通莖段外植體的愈傷組織誘導培養。

結合2.1及2.2的結果綜合考慮，可將外植體先用無菌水浸泡3 min，然后接種至MS+NAA 0.4 mg·L-1+2,4-D 4.0 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1的培養基中進行避光培養來誘導愈傷組織。

2.4 愈傷再分化誘導胚狀體

將試驗得到的愈傷組織接種至添加不同濃度的6-BA和NAA的MS培養基中，誘導再分化，結果見表5。從胚狀體誘導情況來看，誘導率較高的培養基為B5，雖顯著高于其他培養基，但也只有15.33%。其余的培養基類型條件下，則更低。誘導率雖低，但由于胚性愈傷組織可接種至相同培養基上進行增殖，因此，只要誘導得到胚狀體即可進一步誘導成苗。因此，各處理中較好的胚狀體誘導培養基為MS+NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。從褐化率看，各培養基中褐化率都沒有顯著差異，且都較高，但低于見光培養和不加活性炭處理時100%褐化的情況。因此，前述外植體誘導愈傷組織時得到的褐化抑制的條件應用至愈傷組織增殖及胚狀體誘導時，還需進一步進行優化。

誘導得到的胚性愈傷組織接種至胚狀體誘導培養基，并不斷去除褐化及生長不良的的組織后可得到生長較好的胚狀體。由于每個胚狀體為一個完整植物的雛形，將其挑出接種至不含激素的MS培養基中，可生長得到一棵完整的種苗。

表4 不同培養條件對愈傷誘導及褐化的影響Table 4 Effect of different culture conditions on callus induction and browning (%)

表5 激素配比對胚狀體誘導的影響Table 5 Effect of hormone combinations on induction of embryos

圖1 三葉木通胚狀體誘導及成苗Fig.1 Somatic embryo induction and seedling formation of Akebia trifoliate (Thunb.) Koidz.

3 討論

本研究首先得出了合適的外植體滅菌條件，在接種前將外植體于無菌水中浸泡處理3 min，可顯著降低褐化情況的產生，并且可觀察到無菌水由無色透明狀態變為茶色。分析原因可能是浸泡有利于產生褐化的酚類化合物的溶出[19]。對不同激素條件下愈傷誘導的研究表明，莖段愈傷誘導時合適的激素配比為NAA 0.4 mg·L-1+2,4-D 4.0 mg·L-1；葉片愈傷誘導時，合適的激素配比為NAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1。可見，合適的NAA和2,4-D濃度有利于愈傷組織的誘導，這與沈國林等[14]的研究結果一致。

一般而言，避光培養以及添加活性炭可在一定程度上降低褐化的發生[20-21]，這一結論在本研究中也得到了驗證，三葉木通愈傷誘導時，合適的活性炭添加濃度為1.0 g·L-1。在考察褐化抑制常用的液體培養方式時發現，接種的所有外植體均死亡，這與張小紅等[22]及唐利球等[23]的研究結果不同，分析原因可能是不同種類植物基因型差異所致。利用得到的愈傷組織接種至MS+NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1培養基中可誘導得到胚狀體狀態的叢生芽，但誘導率較低，且褐化嚴重。分析原因可能是三葉木通愈傷組織脫分化后再分化比較困難[14-16]。目前，得到叢生芽的研究也只集中在以種子或下胚軸為外植體上[17-18]，因此，三葉木通愈傷組織的再分化條件還需要進一步的優化研究。