響應面試驗優化霍山石斛原球莖增殖培養基

郭慧慧，林叢發，蔣元斌，李志剛

(福建省寧德市農業科學研究所，福建 寧德 355017)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng)是安徽大別山特有的名貴珍中草藥，是蘭科多年生附生草本植物，含有活性多糖、生物堿等多種化合物[1]。現代藥理研究證明，霍山石斛多糖具有抑制人胃癌細胞生長、延緩糖尿病性白內障發展、保護四氯化碳致小鼠急性肝損傷等作用[2-4]。但由于霍山石斛種子繁殖力極低，生長周期長，生長環境要求極為苛刻，加上人為的過度采挖，自然資源已瀕臨滅絕[5]。隨著植物組織培養技術的發展，許多研究者開始利用這項技術解決石斛苗繁殖率低問題，而試管苗繁殖一般需經過原球莖階段。原球莖是霍山石斛體細胞胚，具有和植株同樣的形態發育和物質代謝的潛能[6]，且其具有生長周期短、繁殖率高等特點，可進一步進行代謝產物調控、生化、分子及蛋白質組學分析[7-9]。因而探索原球莖增殖技術將是可持續開發霍山石斛資源的重要技術環節。

響應面設計是以試驗測量、經驗公式和數值分析為基礎，采用多元二次方程來擬合因素和響應值之間的函數關系以尋求最優工藝的一種統計學方法。相比于正交設計和均勻設計，具有試驗次數少、精度高和模型預測性好等優點，現已被廣泛運用于提取工藝和方法優化等領域，能夠反映各因素與響應值之間的關系[10-12]。

本研究應用響應面分析法從不同濃度萘乙酸(NAA)、6-芐氨基嘌呤(簡稱6-BA)和馬鈴薯組合中確定最優的霍山石斛原球莖增殖培養基，旨在為可持續開發霍山石斛資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萘乙酸與6-芐氨基嘌呤購于北京康倍斯科技有限公司；土豆購于福建寧德福安永輝超市；石斛種苗經浙江大學董海濤教授鑒定為霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J Che)，試驗所用原球莖由其種子誘導而來。

1.2 儀器與設備

JB-CJ-2FXS超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；KJ-JD501榨汁機，康佳集團股份有限公司；FA2204電子天平，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1培養方法與條件 在無菌條件下將霍山石斛原球莖分別接種到所配制的增殖培養基中。設NAA濃度、6-BA濃度和馬鈴薯用量3個變量。每一個處理組均含：1/2MS+蔗糖30.0 g/L+瓊脂5.0 g·L-1+變量因子，pH 5.7～5.8,每處理10個平行，每瓶3簇，組培室培養條件為室溫(26±1)℃，光照強度2 000 lx左右，光照時間12 h·d-1。

1.3.2單因素試驗設計 在預試驗的基礎上，分別探討NAA濃度、6-BA濃度和馬鈴薯用量對霍山石斛原球莖增殖率的影響。控制條件6-BA、馬鈴薯和NAA的用量分別為1.0 mg·L-1、150 g·L-1和0.1 mg·L-1，變量因子水平設置見表1[13]。

表1 單因素試驗設計方案Table 1 Single factor experiment design

1.3.3增殖率 未分化原球莖質量為接種60 d后所得的未分化原球莖質量，未分化的原球莖呈淡綠色，頂端有葉原基，但無真葉分化[14]。

原球莖增殖率=[(未分化原球莖質量-接種質量)/接種質量] ×100%

接種質量=接種后瓶重-接種前瓶重

1.3.4響應面試驗設計 在單因素實驗分析結果的基礎上，確定NAA濃度、6-BA濃度、馬鈴薯用量3個因素的適宜范圍(表2)，以原球莖增殖率為響應值。根據Box-Behnken試驗原理進行設計，確定試驗所需總試驗點[15-18]。

N=2f(f-1)+n

式中，N為所需試驗點，f為需要優化的因素數，n為中心點的個數。

本試驗中f為3，n為5，共17個隨機試驗運行優化。隨后對響應面法得到的最優方案進行驗證。

表2 響應面試驗設計因素水平Table 2 Design level table of response surface methodology

1.3.5數據分析 單因素試驗數據處理運用的軟件為DPS7.05，采用最小顯著差數法(P<0.05，LSD)進行不同處理間均值的顯著性差異比較。響應面分析采用Design Expert 8.06軟件。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NAA對霍山石斛原球莖增殖率的影響

植物生長調節劑在培養基中的用量雖然微小，但是其作用很大。生長素在組織培養中的用途主要有誘導愈傷組織形成、誘導根的分化和促進細胞分裂[19]。石斛生長發育過程中主要使用的生長素有IAA、NAA、IBA[20]。如圖1所示，NAA的不同添加量對霍山石斛原球莖增殖的影響。當NAA濃度為0.1 mg ·L-1時，原球莖增殖率最大，NAA濃度太高或太低都會降低原球莖增值率。隨著NAA濃度的增加可觀察到分化的原球莖越來越多。

注：不同字母表示在不同處理下差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.圖1 NAA添加量對霍山石斛原球莖增殖率的影響Fig.1 Effect of NAA dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

注：不同字母表示在不同處理下差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.圖2 6-BA添加量對霍山石斛原球莖增殖率的影響Fig.2 Effect of 6-BA dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

2.2 不同濃度6-BA對霍山石斛原球莖增殖率的影響

細胞分裂素是由根尖合成而向上運輸，主要作用是促進細胞分裂和器官分化，促進側芽分化和生長，抑制頂端優勢，延緩組織衰老等[21]。石斛生長發育過程中主要使用的細胞分裂素有ZT、KT和BA[20]。如圖2可知，6-BA濃度在0.5～1 mg·L-1時，隨著6-BA濃度的增加，原球莖增殖率也在增加；6-BA濃度在1～2 mg·L-1時，隨著6-BA濃度的增加，原球莖增殖率呈下降趨勢。

2.3 馬鈴薯對霍山石斛原球莖增殖率的影響

天然復合物對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，其成分比較復雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物[21]。石斛生產中常使用的天然復合物有香蕉汁、馬鈴薯汁及椰子汁等[22]。由圖3可知，隨著馬鈴薯濃度的增加，原球莖增殖率呈現先升后降的趨勢，濃度為150 g·L-1時原球莖增殖率最高。

注：不同字母表示在不同處理下差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.圖3 馬鈴薯添加量對霍山石斛原球莖增殖率的影響Fig.3 Effect of potato dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

2.4 響應面試驗結果

三因素三水平的二次響應面結果見表3。可以看出，NAA 0.1 mg·L-1，6-BA 1.5 mg·L-1，馬鈴薯添加量150 g·L-1時，原球莖增殖率最高，其均值2 820%～3 260%在之間。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

利用Design Expert 8.06對試驗數據進行分析，得到的擬和全變量二次回歸方程各變量的方差分析如表4所示。

通過Design Expert 8.06軟件對表3試驗數據進行多元回歸擬和，以原球莖增殖率(Y)為響應值，NAA濃度(X1)、6-BA濃度(X2)和馬鈴薯用量(X3)為自變量，獲得回歸方程為：

Y=10 380X1+9 337X2+75.99X3-400X1X2-34.8X1X3-30.68X2X3-38 750X12-2 634X22-0.142 6X32-7 343.5

如表4所示，回歸模型的P=0.005 4，表明該模型是極顯著的。模型失擬項的P=0.118 4，表明模型失擬不顯著，而模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率[23]，即模型失擬項不顯著表明模型穩定。模型的R2為0.914 4，說明回歸擬和程度較好。變異系數(C.V.)值為13.03%，說明模型方程能夠較好地反映真實的實驗值。所以，可以使用該模型來預測NAA濃度、6-BA濃度和馬鈴薯濃度對霍山石斛原球莖增殖的影響。

從表4可見，NAA(X1)和6-BA(X2)濃度的一次項對原球莖增殖率的影響顯著(P<0.05)，而馬鈴薯用量(X3)的一次項對原球莖增殖率的影響不顯著(P>0.05)，可能是由于通過單因素試驗已將馬鈴薯的濃度范圍縮小在一個較合適的區間，在這區間內馬鈴薯濃度的變化對原球莖增殖率的影響不顯著。NAA濃度(X1)的二次項對原球莖增殖率的影響顯著(P<0.05)；6-BA濃度(X2)的二次項對原球莖增殖率的影響極顯著(P<0.01)；馬鈴薯用量(X3)的二次項對原球莖增殖率的影響不顯著(P>0.05)。6-BA濃度和馬鈴薯用量的交互項(X2X3)對原球莖增殖率的影響極顯著(P<0.01)，而NAA和6-BA濃度的交互項(X1X2)與NAA濃度和馬鈴薯用量的交互項(X1X3)對原球莖增殖率的影響不顯著(P>0.05)。

表4 響應面模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface model

2.5 二次擬合響應面分析

由回歸方程得到NAA濃度、6-BA濃度和馬鈴薯用量這3個因素間交互作用對霍山石斛原球莖增殖培養基影響的響應曲面和等高線圖，如圖4～6所示。圖中等高線最小橢圓中心點即擬合曲面的最高點；而等高線的形狀又能反應交互效應的強弱，越接近圓形表示兩因素交互作用越不顯著，越接近橢圓形表示兩因素交互作用越顯著[15]。由圖4～6可知，三個擬合曲面都具有最高點。從等高線形狀來看，6-BA濃度和馬鈴薯用量兩者交互作用變化非常明顯(圖6)，相比于NAA濃度和6-BA濃度(圖4)、NAA濃度和馬鈴薯用量(圖5)，交互作用非常顯著(P<0.01)。NAA濃度和6-BA濃度對增殖率的交互影響不顯著(圖4)，當馬鈴薯用量位于中心水平(150 g·L-1)時，增殖率隨6-BA濃度和NAA濃度的增加均呈現先升后降的趨勢。NAA濃度和馬鈴薯用量對增殖率的交互影響也不顯著(圖5)，當6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，增殖率隨NAA濃度和馬鈴薯濃度的增加均呈現先增加后降低的趨勢。

圖4 NAA和6-BA添加量對原球莖增殖率影響的響應面曲面和等高線Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effects of NAA and 6-BA dose on protocorm proliferation rate

圖5 NAA和馬鈴薯添加量對原球莖增殖率影響的響應面曲面和等高線Fig.5 Response surface plot and contour plot showing the effects of NAA and potato dose on protocorm proliferation rate

圖6 6-BA和馬鈴薯添加量對原球莖增殖率影響的響應面曲面和等高線Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effects of 6-BA and potato dose on protocorm proliferation rate

應用Design Expert 8.06軟件對二次多項式回歸方程進行計算，確定最佳三因素組合為NAA濃度0.05 mg·L-1、6-BA濃度0.67 mg·L-1、馬鈴薯用量188.96 g·L-1，此條件下霍山石斛原球莖增殖率為3 193.79%。考慮實際操作，將NAA濃度、6-BA濃度、馬鈴薯用量分別修正為：0.05 mg·L-1、0.70 mg·L-1、185 g·L-1。在此條件下進行驗證試驗，得到霍山石斛平均增殖率為2 989.82%±205.55%，與模型預測值3 193.79%非常接近。

3 討論

隨著野生資源的過度開采及市場需求的增加，利用離體快繁技術進行原球莖增殖被認為是解決霍山石斛藥源的有效途徑。而原球莖的生長受到植物生長調節劑、添加物、培養方式、培養基滲透壓等諸多因素的影響。戴傳云等[24]研究表明，高濃度的6-BA與低濃度的NAA組合，原球莖增殖系數大，增殖效果較好，NAA對原球莖增殖的影響大于6-BA。謝純[25]研究表明，當NAA濃度固定時，隨6-BA濃度不斷升高，原球莖增殖速度加快，但當濃度高于1.5 mg·L-1時，原球莖生長速度反而減慢；當6-BA濃度固定時，NAA對原球莖增殖速度的影響表現為先增后減，濃度為0.5 mg·L-1時原球莖長勢最好，這與本研究的結果相似。肖小君等[26]研究表明，馬鈴薯汁可促進鐵皮石斛原球莖增殖，且原球莖飽滿，顏色濃綠，長勢旺盛。蘇江[27]研究表明，甘露醇可用來調節石斛培養基滲透壓，添加低濃度的甘露醇可促進石斛原球莖的生長。侯丕勇等[28]研究表明，減低固體基本培養基元素的含量有利于原球莖的生長，但不利于原球莖的分化。萬珠珠等[29]研究表明，相比塑料杯，玻璃瓶中的原球莖增殖系數大，萌發度高，生長健壯。

目前，石斛原球莖增殖因素優化使用的方法多為單因素試驗和正交試驗設計法，利用響應面法優化原球莖增殖培養基的方法尚未見報道。單因素試驗實驗設計簡單，但忽略了因素之間的交互作用。正交試驗可同時考慮幾種因素，尋求最佳組合，但無法找到整個區域的最優值。本研究使用的響應面法即可考察因素之間的交互作用，又可尋找到整個區域內的最優解，進一步降低了培養基用量，從而降低成本。試驗通過單因素試驗確定了主要因素及因素最佳濃度存在的范圍后，再通過響應面分析充分考慮NAA、6-BA和馬鈴薯之間的交互作用，并通過相應曲面尋找最優解。臧琛等[30]研究表明響應面法可用于石斛真空冷凍干燥工藝條件的優化，其建立的模型預測性較好。彭文書等[12]研究表明響應面法建立的模型預測性良好，可用于石斛生根培養基的優化。荊晶等[31]研究表明響應面法可對微波輔助法提取石斛多糖工藝條件進行優化，所得工藝穩定可靠，方便可行。本研究應用響應面法優化霍山石斛原球莖增殖培養基，以期為霍山石斛藥源工廠化生產提供理論和實踐依據。