小麥類鈣調素新亞型基因TaCML25/26調控抗葉銹性

劉鵬， 韋杰， 楊毅清， 張娜， 溫曉蕾,2， 范學鋒，楊文香*， 劉大群*

(1河北農業大學植物病理學系，河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心，國家北方山區農業工程技術研究中心，河北 保定 071001；2 河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北 秦皇島 066004)

小麥葉銹病由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)引起，在世界范圍內普遍發生，發生嚴重時可造成40%甚至更高的產量損失[1]，嚴重威脅糧食安全。抗病基因的利用是控制小麥葉銹病的有效途徑。Ca2+-CaM信使系統在小麥抗病過程發揮著重要作用[2-4]。Ca2+是多種生物脅迫和非生物脅迫信號轉導中的第二信使，其廣泛存在于植物細胞中，通過將來自胞外刺激傳遞至胞內，調節胞內反應[5]。植物中Ca2+結合蛋白包括CaMs(鈣調蛋白)、CMLs(鈣調蛋白類蛋白)、CDPKs/CPKs(Ca2+依賴性蛋白激酶)、CBLs(鈣調蛋白類蛋白)和CIPKs(CBL互作蛋白激酶)。CaM在結構上高度保守，存在于所有真核生物中，而CMLs、CPKs以及CBLs僅存在于植物和原生生物中[6]。鈣調蛋白(CaM)是細胞內主要的Ca2+受體，通過EF-hand結構域識別并結合特定的Ca2+信號，通過與靶鈣調蛋白結合蛋白(CaMBP)的鈣調蛋白結合結構域(CaMBD)互作來轉移Ca2 +信號[7-8]。CML是與CaM相似性較高的鈣離子結合蛋白大家族，具有2～6個EF-hand結構域，無任何其他已知的功能結構域[9-10]。

CaM/CML的許多靶蛋白直接或間接調節植物對環境脅迫的反應[11]。已有研究表明，擬南芥中AtCML20[12]、AtCML36[13]和AtCML39[14]及番茄中的ShCML44[[15]在植物的抗逆過程中發揮重要作用。同時發現植物的CaM/CML基因在植物的不同組織中具有表達特異性。前人通過組織RNA印跡和熒光定量分析發現小麥[16]、馬鈴薯[17]、大豆[18]的CaM/CML基因在不同器官中均有不同程度的表達。水楊酸(salicylic acid, SA)、脫落酸(abscisic acid, ABA)作為重要的信號分子調控植物的抗病反應[19-20]。外源植物激素脫落酸誘導TaCaM5上調表達，水楊酸誘導其下調表達[3]；擬南芥中AtCML24負向調節植物對ABA抗性[21]；受鈣/鈣調素信號控制的AtSR1/CAMTA3轉錄因子可以抑制R基因激發的抗病信號基因EDS1和NDR1的表達進而防止SA的過度產生[22]。

CaMs和CMLs也被證明參與植物的防御反應。Choi等[23]發現辣椒鈣調蛋白CaCaM1參與細胞死亡和防御反應，而且是活性氧(reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(NO)形成所必需的。擬南芥中，AtCML24[21]、AtCML9[24]、AtCML8[25]、AtMPK8[26]、AtCBP60g[27]和AtCAMTA3[28]參與植物的防御反應。AtCML9[24]和AtCML8[25]正向調節對丁香假單胞菌的防御反應；AtMPK8[26]調節ROS含量、CaM結合蛋白CBP60g[27]調節SA含量及AtCAMTA3負向調節SA合成基因EDS1的表達，參與植物的防御反應[28]，CaM還可通過調節氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)合成和GABA分流代謝途徑間接參與調節ROS含量參與植物的免疫反應[29]。

目前，從小麥(TriticumaestivumL.)中鑒定出40個CaM基因，這些基因分別編碼13個鈣調蛋白CaM[5]。根據TaCaMs的系統發育樹及其基因結構和基序，將這些TaCaM基因分為三個亞家族：TaCaM I、TaCaM Ⅱ和TaCaM Ⅲ[6]。研究表明，小麥類鈣調素基因TaCML20[30]通過調節水溶性碳水化合物(water soluable carbohydrate, WSC)的濃度參與植物的干旱反應，TaCML79基因在根和地上部分受到熱激、NaCl、滲透和冷脅迫的誘導或抑制，推測該基因可能與植物抗逆有密切相關性[31]。小麥類鈣調素基因TaCML36通過調節乙烯信號通路中可能存在的抗病相關基因的表達，參與對土傳真菌Rhizoctoniacerealis防御反應[32]；TaCaM5可能通過茉莉酸和乙烯等信號途徑參與小麥對條銹菌的防御反應，同時參與機械傷害、低溫和干旱環境下Ca2+-CaM信號轉導途徑[3]。

前期研究表明，Ca2+-CaM/CML信使系統可能在小麥抗葉銹病過程中起著重要作用[2]，并且不同的CaM亞型可能調控不同的抗病途徑[33]。Wang等[34]通過實時定量試驗發現鈣調蛋白結合轉錄激活因子TaCAMTA4在小麥抵抗葉銹菌侵染過程前期起負調控作用。然而CAMs/CMLs參與小麥—葉銹菌互作信號通路的分子機制尚不清楚，關于CaMs/CMLs在小麥抗葉銹菌中的作用有待深入研究。

本研究前期發現在TcLr19和其感病突變體中存在一個顯著差異表達的CaM/CML基因，該基因與抗葉銹性之間的關系有待于明確。因此，本研究從小麥cDNA中分離克隆抗感不同文庫中顯著表達的CML基因，分析其基本特性和小麥與葉銹菌互作及激素SA、ABA誘導下的表達特征，研究為深入分析與了解CML基因的功能及其在抗病中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19、小麥感病突變體Mu19、小麥葉銹菌種THTT(對TcLr19表現低毒力，對Mu19表現高毒力)皆由河北農業大學小麥葉銹病研究中心提供。

將TcLr19和Mu19的種子播種于直徑為10 cm，高度為10 cm的花盆中播種，每盆種10～15粒，置于溫度18～25 ℃、光照10～14 h的溫室內培養。待幼苗長至一葉一心期，將葉銹菌菌株THTT的夏抱子均勻接種在部分幼苗葉片上，接種后噴水霧保濕，置黑暗條件下14～16 h，然后繼續轉入溫室培養。取剩余幼苗分別用5 mmol·L-1SA、0.01 mmol·L-1溶液噴灑葉片表面直至溶液滴下，然后繼續轉入溫室培養。分別于接種或噴灑激素后0、6、12、24、36、48、72、96、120 和144 h剪取葉片0.1 g，液氮速凍，-80 ℃儲藏備用。其中，小麥葉片接種或噴灑清水為對照。生長2周的幼苗根、莖和葉用于不同組織表達研究。

1.2 試驗儀器和試劑

試驗使用的儀器包括：PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)、Real-time PCR定量儀(Lightcycler?96, Rocle公司)、電子天平(美國Adventurer公司)。

TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit購自日本TaKaRa公司，DNA回收試劑盒、DNA小量抽提試劑盒均為上海生工生物工程有限公司生產，熒光定量試劑為北京全式金公司生產，反轉錄試劑盒采用ABM公司的5×All-In-One RT MasterMix。引物合成及測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 植物總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction試劑盒提取植物RNA，每個樣品設置4個生物學重復。cDNA第1鏈的合成利用ABM公司的5×All-In-One RT MasterMix。

1.4 小麥TaCML25/26基因的克隆

以小麥近等基因系TcLr19的cDNA為模版，利用Primer 5已經設計好的引物進行PCR擴增。上游引物TaCML25/26-F：3’-A A T T T G G T G A C A A G G T T G C T A GG，下游引物TaCML25/26-R：3’-G G G C A A A A C A A T G A AT G A A T G AA。

PCR反應體系：cDNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 0.5 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，DNA聚合酶(1.5 U) 0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。回收PCR產物片段與pMD19-T Vector(TaKaRa)連接，轉化E.coliDH5α，酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行測序驗證。

1.5 TaCML25/26 生物信息學分析

使用NCBI的Blastx對TaCML25/26基因進行序列分析；使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預測CML蛋白質分子量和理論等電點；用NetPhos 2.0 Server(http://www.Cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測CML蛋白質磷酸化位點；用SingalP 5.0 Server預測CML氨基酸序列的信號肽；用TMHMM Server V.2.0 預測CML氨基酸序列的跨膜結構域；用TargetP預測CML蛋白的亞細胞定位；用DNAMAN進行CML氨基酸的多序列比對；利用MEGA 6構建CML的系統進化樹；用SWISS-MODEL space(https://www.swissmodel.expasy.org/)構建CML的三維模型。

1.6 實時熒光定量PCR

參照TransStartTop Green qPCR SuperMix試劑盒的實時熒光定量PCR引物原則，設計目標基因qRT-PCR引物，上游引物TaCML25/26-qRT-F：3’-G A C C A T G G TG G T A C C G T CG；下游引物TaCML25/26-qRT-R：3’-C G G A T A T G T C C T C G C C C A AG。 以小麥GAPDH為內參，實時熒光定量PCR反應體系 25 μL：qPCR Master Mix(2×) 12.5 μL、cDNA模板4 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各0.8 μL和去離子水6.9 μL。反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，35個循環。根據擴增曲線確定每個基因和樣本相應的Ct值，以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt[35]方法計算。

2 結果與分析

2.1 TaCML25/26基因克隆及序列分析

根據本研究前期獲得的文庫中的顯著差異表達的CaM/CML序列，從小麥近等基因系TcLr19的cDNA中擴增獲得一條長度為458 bp的序列，編碼147個氨基酸，理論等電點為4.55，分子量為16.59 kD。序列分析結果顯示TaCML與粗山羊草AtCML25/26相近，相似性為99%，將該基因命名為TaCML25/26。保守結構域預測表明該蛋白具有一個EF-hand_8結構以及多個EFh保守結構域結構，分別位于序列314～449和36～445區(圖1)。

圖1 TaCML25/26蛋白的EF手型保守結構域Fig.1 EF-hand domains in TaCML25/26

將TaCML氨基酸序列與其他物種進行同源比對，分析結果表明，TaCML25/26與粗山羊草的CML的親緣關系最近，與穿心蓮的親緣關系次之(圖2)。

圖2 TaCML25/26 與其他物種CML的進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of TaCML25/26 and other CML

通過氨基酸序列比對和系統進化樹分析發現(圖3)，TaCaM Ⅰ與TaCaM Ⅱ有兩個氨基酸的差異，分別位于第125、139位氨基酸。與TaCaM Ⅰ和TaCaM Ⅱ相比，TACaM Ⅲ(TaCaM 2-1(AAC49581.1))N端前24個氨基酸特異性較強，TaCaM5與TaCaM Ⅰ和TaCaM Ⅱ相比，存在21個差異氨基酸，均勻分布于整個氨基酸序列，與TaCaM Ⅲ相比共有39個差異氨基酸，其中19個氨基酸集中分布N端，其余差異氨基酸均勻分布于整個氨基酸序列。本研究克隆到的小麥CML基因TaCML25/26，編碼147個氨基酸，與TaCaM Ⅰ、TaCaM Ⅱ、TaCaM Ⅱ和TaCaM5相比，序列形似性分別為31.21%、31.21%、28.76%和29.30%。對其蛋白結構進行分析發現，這些基因均含有Ca2+結合位點和EFh保守結構域，與TaCaM Ⅰ、TaCaM Ⅱ、TaCaM Ⅲ和TaCaM5相比，TaCML25/26含有EF-hand_8結構域和多個EFh保守結構域，Ca2+結合位點位于N端，與上述基因家族存在顯著差異，聚類分析顯示該蛋白單獨聚為一類(圖4)。因此可以確定TaCML25/26為一個新的小麥CML亞型基因。

圖3 TaCML25/26與小麥其他CaM亞型的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of TaCML25/26 and other wheat CaM isoforms

2.2 TaCML25/26理化性質

依據ProtParam預測TaCML25/26編碼29個酸性氨基酸(Asp+Glu)，16 個堿性氨基酸(Arg+Lys)。使用NetPhos 2.0 Serve進行磷酸化位點預測，結果顯示TaCML25/26編碼的兩條氨基酸序列中均含有1個蘇氨酸(threonine)位點、2個絲氨酸(serine)位點和3個酪氨酸(tyrosine)位點，說明鈣調蛋白的活性可能受磷酸化作用的調控。

使用Singal P 5.0 Server進行信號肽預測，結果顯示TaCML25/26編碼的氨基酸序列均無信號肽位點，可以判斷鈣調蛋白屬于非分泌性蛋白質。使用TMHMM Server V. 2.0預測顯示TaCML25/26編碼的氨基酸序列無跨膜結構。TargetP預測顯示TaCML25/26在cTP(葉綠體轉運肽)、mTP(線粒體靶向肽)和SP(分泌通路信號肽)值分別為0.389、0.050、0.189，而在其他細胞器的預測值高達0.263，表明鈣調蛋白主要存在于線粒體以外的其他細胞器中。使用SWISS-MODEL space模擬CML蛋白的三維結構，如圖4所示。可以看出，蛋白兩端含有多個β折疊，中間以無規卷曲相連接，β角的勢能為-3.38，殘基包埋值為-0.55，扭轉角為-0.06，QMEAN值為-0.96。

圖4 TaCML25/26蛋白三維結構Fig.4 3-D structure of TaCML25/26 protein

2.3 TaCML25/26基因的表達特性

2.3.1葉銹菌誘導TaCML25/26基因的表達模式 為了解TaCML25/26基因在小麥與葉銹菌互作過程中不同時間點的表達特征，設計特異引物進行了熒光定量PCR的檢測。結果發現，TaCML25/26基因的轉錄表達受小麥葉銹菌的誘導(圖5)，在小麥近等基因系TcLr19中，接種24 h后，TaCML25/26上調表達，為在Mu19中表達量的4倍，之后表達量有所下降。在接種葉銹菌120 h時，該基因在感病突變體Mu19中達到高峰，比在TcLr19的表達高峰晚出現96 h，但此時比在TcLr19中的表達量高7.5倍，之后有所下降，但仍顯著高于在TcLr19中的表達量。該基因在Mu19和TcLr19中基因的表達趨勢與轉錄組數據庫中的表達一致。

注：*和**表示差異在P<0.05和P<0.01水平具有統計學意義。Note: * and ** indicate significant difference at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively.圖5 TaCML25/26基因在葉銹菌與TcLr19和Mu19互作過程中表達特征Fig.5 Expression pattern of TaCML25/26 in the interaction between leaf rust and TcLr19 and Mu19

2.3.2SA、ABA誘導下TaCML25/26基因的表達模式 用5 mmol·L-1SA處理TcLr19，TaCaM25/26基因在0～6 h表達量上升，在6 h達到第一個表達高峰，隨后下降，12 h再次上升，24 h達到第二個表達高峰，略微下調后再次上調表達，48 h到達到表達量的最大值(第三個高峰)后再次下降，72 h表達量再次上升，于96 h達到表達量的第四個高峰，隨后急劇下降(圖6)。差異顯著性分析結果表明，在6、48 和96 h時，5 mmol·L-1SA處理下TcLr19中TaCaM25/26基因的表達量顯著高于清水對照(圖6)。

注：*和**表示差異在P<0.05和P<0.01水平具有統計學意義。Note: * and ** indicate significant difference at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively.圖6 TaCML25/26在不同激素處理下的表達特征Fig.6 Expression pattern of TaCML25/26 under different hormone treatments

用0.01 mmol·L-1ABA處理TcLr19，TaCaM25/26基因在0～6 h表達量上升，在6 h達到表達量的第一個高峰，隨后下降，12 h時再次上升，24 h到達到表達量的第二個高峰后再次下降，36 h時表達量再次上升，于72 h達到表達量的第三次高峰，此時表達量最高隨后下降，144 h時又有所上升(圖6)。差異顯著性分析結果表明，在6、24 和72 h時，0.01 mmol·L-1ABA處理下TcLr19中TaCaM25/26基因的表達量顯著的高于清水對照(圖6)。

2.3.3TaCML25/26基因組織表達特征 定量結果顯示，TaCML25/26在根、莖、葉等組織中均表達，表達量在根部最高，莖部次之，葉部最少, 約為根部表達量的 1/8 (圖7)。

圖7 TaCML25/26 在小麥不同組織中的表達量Fig.7 Expression pattern of TaCML25/26 in different wheat organs

3 討論

鈣離子(Ca2+)是植物中的次級信號分子，廣泛存在于植物細胞中，主要為胞內信使，與鈣調蛋白(CaM)同源的Ca2+結合蛋白的互作進行Ca2+的信號傳導，其將來自細胞外的刺激傳遞至細胞內，調節胞內反應[5]。典型的CaM非常保守，一般由149個氨基酸組成，具有4個EF-hand結構域，CML是與CaM相似性較高的鈣離子結合蛋白大家族，蛋白長度一般為83～315個氨基酸不等，具有2～6個EF-hand結構域[9-10]。本研究通過PCR方法克隆得到一個小麥基因TaCML25/26，生物信息學分析顯示，TaCML25/26基因ORF序列大小是458 bp，編碼147個氨基酸；蛋白序列的同源比對和系統進化樹分析顯示，TaCML25/26與粗山羊草的CML25/26的親緣關系最近，并且TaCML25/26具有一個EF-hand_8結構以及多個EFh保守結構域，與小麥鈣調素類其他家族存在顯著差異，說明該基因為小麥中新發現的CML基因。其是否具有結合Ca2+的特性還需更深入的研究。

植物激素調節是植物中非常重要的抗病機制，其中水楊酸、脫落酸作為重要的信號分子調控植物的抗病反應[19-20]。TaCaM5[3]、TaABCF[36]受植物激素SA和ABA誘導表達。本研究發現，TaCML25/26在SA和ABA處理下，6 h達到第一表達高峰，隨后下調表達，在12 h后均開始上調表達，SA處理后，48 h達到表達最大值，ABA處理在72 h達到表達最大值，說明TaCML25/26受水楊酸和脫落酸誘導表達。

小麥[16]、馬鈴薯[17]、大豆[18]的CaM/CML基因在不同器官中均有不同程度的表達。本研究表明，TaCML25/26在小麥根、莖、葉等組織中均有表達，但在不同器官中表達量存在明顯差異，其中表達量在根部最高，莖部次之，葉部最少，約為根部表達量的1/8(圖7)。具體其在各器官中的功能有待于進一步研究。

CML基因廣泛參與到植物的多種信號通路中，研究證實，Ca2+依賴性CaM/CML信號轉導通路在植物防御反應中起重要作用[2-4]。CaCaM1過表達激活辣椒中ROS和NO產生，誘發過敏性壞死反應(hypersensitive response，HR)和防御相關基因表達[23]，沉默NtCaM13后發現煙草對病毒、病原細菌和真菌的感病性增加[37]，過表達擬南芥中APR134同源基因AtCML43能夠增強植株的過敏性壞死反應[38]，而擬南芥CML24敲除突變體對Pst無毒株侵染的植株的HR反應明顯減弱[21]。小麥中TaCaM5[3]則可能通過茉莉酸和乙烯等信號途徑參與小麥對條銹菌的防御反應，鈣調蛋白結合轉錄激活因子TaCAMTA4在小麥抵抗葉銹菌侵染過程前期中起負調控作用[34]。本研究發現小麥葉銹菌侵染小麥葉片后,TaCML25/ 26 在感病的Mu19 中表現出對葉銹菌侵染的敏感，接種后96 h 該基因的表達量迅速上升， 120 h 到達表達高峰，遠遠高于抗病的TcLr19，說明小麥細胞內鈣調素可能作為后期的信號分子參與葉銹侵染過程。從葉銹病的發展過程上看，接種后120 h,葉銹菌在感病的寄主上已經完成侵染，并且在不斷擴展，為夏孢子的形成做準備，此時該基因的高表達可能與葉銹菌的擴展和孢子形成有關。在TcLr19 中，接種24 h 時TaCML25/ 26表達量上升且達到高峰，而此時葉銹菌在努力與抗病基因進行互作，抗病基因在積極響應病原物的刺激，葉銹菌與寄主細胞存在大量的信號交換和互作，這個過程中涉及到過敏性的反應的發生，TaCML25/ 26 可能參與了這一過程。TaCML25/ 26 在抗病和感病寄主中扮演的具體角色尚需今后開展深入研究，在后續工作中將通過BSMV-VIGS 等技術研究TaCML25 / 26 基因的功能及其作用的靶標。