高通量測序技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物分子特征評價(jià)中的應(yīng)用

馬碩, 焦悅, 王旭靜, 翟勇, 王志興*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)(分子)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心, 北京 100122)

分子特征是指轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA片段在受體基因組中的整合(包括插入外源基因的拷貝數(shù)、插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列、插入序列的完整性、是否有載體骨架序列的插入等)、表達(dá)以及遺傳穩(wěn)定性等方面的信息，是建立轉(zhuǎn)基因植物精準(zhǔn)檢測技術(shù)的依據(jù)，也是轉(zhuǎn)基因植物安全評價(jià)的主要內(nèi)容和核心。目前，插入外源基因的拷貝數(shù)可以通過Southern雜交、熒光定量PCR或數(shù)字PCR來進(jìn)行解析[1-3]，插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列可以通過基于PCR的染色體步移技術(shù)獲得[4-9]。但這些技術(shù)僅能對外源插入片段整合情況比較簡單的轉(zhuǎn)基因作物的分子特征進(jìn)行有效解析，難以獲得同一位點(diǎn)插入多個(gè)拷貝和多個(gè)外源基因復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物以及基因編輯、RNAi等新型轉(zhuǎn)基因作物的精準(zhǔn)分子特征信息。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展和大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，高通量測序成為精準(zhǔn)解析轉(zhuǎn)基因生物分子特征的一項(xiàng)新技術(shù)，其具有高通量、靈敏度高、可操作性強(qiáng)和可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)。基于高通量測序分析轉(zhuǎn)基因生物分子特征獲得的數(shù)據(jù)已經(jīng)被美國、加拿大、歐盟等國家監(jiān)管部門所接受，用于轉(zhuǎn)基因生物的安全評價(jià)。在我國轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中，可否接納高通量測序數(shù)據(jù)，以何種方式接納數(shù)據(jù)以及測序數(shù)據(jù)以何種方式呈現(xiàn)等都是目前需要解決的主要問題。鑒于此，本文綜述了測序技術(shù)的發(fā)展、高通量測序技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物分子特征解析中的應(yīng)用、國外轉(zhuǎn)基因植物安全評價(jià)中對高通量測序數(shù)據(jù)的要求等，并提出了我國采用高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)的建議，為其在我國轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中的應(yīng)用提供理論支撐。

1 轉(zhuǎn)基因植物分子特征解析常用方法

目前，分析轉(zhuǎn)基因植物分子特征的常用方法包括Southern雜交、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、數(shù)字PCR、基于PCR的染色體步移技術(shù)等(表1)，這些方法都得到了有效的驗(yàn)證和使用。其中，Southern雜交、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和微滴數(shù)字PCR是分析外源基因拷貝數(shù)的常用方法。Southern雜交是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管部門認(rèn)可的分析方法，具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但無法正確分析同一位點(diǎn)插入多個(gè)拷貝的復(fù)雜情況，也無法明確插入片段是否有缺失或突變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種相對定量分析外源基因拷貝數(shù)的方法，需要利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，還需要選擇已知拷貝數(shù)的基因作為參考基因，因此，結(jié)果易受引物和探針濃度、DNA純度等因素的影響[10]。數(shù)字PCR操作流程相對簡單，在測定過程中無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)了對外源基因的絕對定量。但存在對熒光探針的特異性要求高、成本高、微滴形成卡的通量低等不足。

表1 常用轉(zhuǎn)基因植物分子特征解析方法Table 1 Common method for molecular character analysis of transgenic plant

基于PCR的染色體步移技術(shù)包括TAIl-PCR(thermal asymmetric interlaced)[11]、反向PCR(inverse PCR)[7]和連接介導(dǎo)的PCR(ligation-mediated PCR)[9]等，是分析轉(zhuǎn)基因生物中外源基因測序序列的常用方法。利用這些方法，成功的獲得了轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花等轉(zhuǎn)基因作物的側(cè)翼序列[12-16]。但這些技術(shù)在擴(kuò)增過程中經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生非特異條帶，不適合用于多位點(diǎn)插入轉(zhuǎn)化事件的側(cè)翼序列分析[17]，而且當(dāng)插入片段發(fā)生序列重排時(shí)，上述方法很難確定外源基因在受體生物基因組中的位置和插入片段的完整性[18]。

2 DNA測序技術(shù)的發(fā)展

DNA測序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代， Sanger和Coulson于1975年發(fā)明了鏈終止測序法(Sanger測序)[19]。1977年，Maxam等[20]發(fā)明了化學(xué)降解測序法。1977年，首次利用Sanger測序測定了噬菌體X174的長度為5 375 bp的基因組全序列[21]。自此，人類開始利用基因組學(xué)大數(shù)據(jù)探究生命遺傳差異的本質(zhì)，步入基因組學(xué)時(shí)代。

Sanger測序被稱為第一代測序技術(shù)，其原理是利用雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)在DNA合成過程中不能形成磷酸二酯鍵而中斷DNA合成，即鏈終止法測序。在測序過程中需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具有測序讀長較長、準(zhǔn)確度高達(dá)99.999%的特點(diǎn)，但存在測序成本高和通量低的缺點(diǎn)。

2005年，454公司推出了基于焦磷酸測序法的GS-20測序系統(tǒng)，標(biāo)志著高通量測序開始，是新一代測序技術(shù)的里程碑事件。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳，具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、高靈敏度和高自動(dòng)化等特點(diǎn)[22]。 2006年，Illumina推出了基于可逆鏈終止物和合成測序法的HiSeq技術(shù)。2007年，ABI公司推出了基于連接酶法的Solid測序技術(shù)，此技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量[23-24]。這些高通量測序技術(shù)被稱為第二代測序技術(shù)，具有通量高、成本低等特點(diǎn)[25]。

2009年，由PacBio公司研發(fā)的SMRT測序技術(shù)問世，步入單分子測序時(shí)代[26-27]。隨后出現(xiàn)的單分子測序技術(shù)還包括Oxford Nanopore 公司的納米孔單分子測序技術(shù)[28-29]。這些技術(shù)不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能有效避免因PCR偏向性而導(dǎo)致的系統(tǒng)錯(cuò)誤，同時(shí)讀長明顯提高，可以達(dá)到2 000 bp以上，被稱為第三代測序技術(shù)(表2)。

表2 測序平臺(tái)間比較[19-30]Table 2 Comparison of different sequencing plat[19-30]

3 高通量測序技術(shù)解析轉(zhuǎn)基因分子特征

3.1 捕獲測序解析轉(zhuǎn)基因生物分子特征

捕獲測序是指將基因組DNA片段化后，根據(jù)轉(zhuǎn)化載體的已知序列設(shè)計(jì)探針，利用探針捕獲目標(biāo)DNA片段，富集后再進(jìn)行測序的一項(xiàng)技術(shù)。目前根據(jù)設(shè)計(jì)探針的位置不同，可以分為T-DNA捕獲測序和SBS(Southern by sequencing)兩種技術(shù)體系。

3.1.1T-DNA捕獲測序技術(shù) T-DNA 捕獲測序技術(shù)利用T-DNA邊界序列作為探針捕獲T-DNA和基因組的結(jié)合區(qū)，然后通過測序獲得外源DNA片段插入信息的一種技術(shù)(圖1)。探針長度一般為70 bp，5’端生物素化。Lepage等[31]利用T-DNA捕獲和454測序技術(shù)獲得了55個(gè)擬南芥突變體的T-DNA插入信息。Inagaki等[32]利用T-DNA捕獲和Illumina測序技術(shù)對29個(gè)擬南芥樣品進(jìn)行了分子特征分析，獲得了22個(gè)樣品的T-DNA插入信息，其中有4個(gè)樣品為多位點(diǎn)插入，證明T-DNA捕獲測序技術(shù)是分析轉(zhuǎn)基因生物分子特征的快速有效方法。但此技術(shù)只能用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因生物中外源插入片段側(cè)翼序列的分析，無法解析插入片段的完整性和是否有載體骨架的插入。

3.1.2SBS技術(shù) SBS技術(shù)是依據(jù)轉(zhuǎn)化載體的DNA序列設(shè)計(jì)一系列帶有標(biāo)記的探針，利用這些探針與受體基因組DNA片段雜交，對捕獲到的DNA片段進(jìn)行測序，通過分析結(jié)合區(qū)序列來確定外源基因在轉(zhuǎn)基因生物基因組中的整合情況(圖2)。

Zastrow-Hayes等[33]構(gòu)建了115 kb的包含有89個(gè)轉(zhuǎn)化載體序列的捕獲探針庫，利用SBS技術(shù)對79個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因的拷貝數(shù)進(jìn)行了分析，獲得的結(jié)果與Southern結(jié)果一致，證明SBS技術(shù)是分析轉(zhuǎn)基因生物分子特征的有效方法。

3.2 全基因組測序解析轉(zhuǎn)基因生物分子特征

全基因組測序首先通過對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行基因組測序，然后再利用載體DNA序列從測序數(shù)據(jù)中捕獲外源插入DNA序列及外源DNA與受體基因組結(jié)合區(qū)序列，根據(jù)結(jié)合區(qū)序列分析轉(zhuǎn)基因生物分子特征。此方法既可以用于分析轉(zhuǎn)基因生物中外源插入序列的側(cè)翼序列，也可以分析外源插入序列的拷貝數(shù)，是目前常用的分子特征解析方法(圖3)。

Kovalic等[35]利用全基因組測序技術(shù)和接合區(qū)序列分析獲得轉(zhuǎn)基因大豆MON17903和MON87704的分子特征信息，通過與Southern雜交結(jié)果進(jìn)行比較，二者的結(jié)果一致，證明全基因組測序技術(shù)是分析轉(zhuǎn)基因生物插入拷貝數(shù)的有效方法。Wahler等[18]利用HiSeq GAII測序平臺(tái)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻LLRice62中外源插入序列的側(cè)翼序列，明確了外源基因在基因組中的插入位點(diǎn)。Guo等[36]利用HiSeq 2500測序平臺(tái)獲得了耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆中外源插入片段的側(cè)翼序列，測序深度為21×。Guttikonda等[37]以轉(zhuǎn)基因大豆TE1、TE2和TE1×TE2為試驗(yàn)材料，證明全基因組測序和捕獲測序是分析轉(zhuǎn)基因生物分子特征的有效方法。Park等[38]利用HiSeq 2500測序平臺(tái)獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻SNU-Bt9-5、SNU-Bt9-30和SNU-Bt9-109中外源插入片段的側(cè)翼序列，測序深度大于54×。Cade等[39]以轉(zhuǎn)基因玉米5323和MIR152為試驗(yàn)材料，證明全基因組測序技術(shù)在拷貝數(shù)分析、非預(yù)期插入的鑒定和小片段插入分析方面，與Southern雜交具有相同的靈敏性，是分析轉(zhuǎn)基因玉米分子特征的有效方法。

4 基因組測序數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中的應(yīng)用

隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，已有越來越多的國家認(rèn)可利用基因組測序技術(shù)來分析轉(zhuǎn)基因生物分子特征，并在安全評價(jià)中接受利用基因組測序技術(shù)獲得的分子特征數(shù)據(jù)和信息。目前,美國、澳大利亞、阿根廷、歐盟和加拿大等12個(gè)國家或地區(qū)接受基因組測序技術(shù)數(shù)據(jù)用于分析轉(zhuǎn)基因生物的分子特征。其中歐盟和加拿大已出臺(tái)了相應(yīng)的指南，對測序要求、數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式等進(jìn)行了規(guī)定和說明。

4.1 歐盟在轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中對提交基因組測序數(shù)據(jù)的要求

2018年6月，歐盟發(fā)布了《用于鑒定轉(zhuǎn)基因植物分子特征的DNA測序質(zhì)量的技術(shù)說明》，對采用測序技術(shù)解析轉(zhuǎn)基因生物分子特征時(shí)的DNA樣品準(zhǔn)備、測序要求、提交數(shù)據(jù)格式等方面進(jìn)行了明確規(guī)定[40]。

首先，DNA樣品必須來自待評估的轉(zhuǎn)基因植物。提交的評價(jià)材料中應(yīng)詳細(xì)描述轉(zhuǎn)基因植物中的包含的轉(zhuǎn)化事件、植物材料的來源、取樣的具體過程和時(shí)間、取樣的部位、取樣的樣本數(shù)、DNA的提取過程等信息。為了便于重測序檢驗(yàn)，申請者應(yīng)儲(chǔ)存至少能滿足三次測序所需的樣品DNA量。

在測序方面，需提供測序文庫的制備過程、測序方法和測序平臺(tái)的詳細(xì)信息。如果使用了捕獲技術(shù)，還應(yīng)提供探針的設(shè)計(jì)、雜交過程、如何評估雜交條件和捕獲效率等方面的詳細(xì)資料。為評估測序數(shù)據(jù)的可靠性，應(yīng)提供測序深度方面的信息。當(dāng)利用全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)識別插入DNA和可能插入的骨架序列時(shí)，必須估計(jì)全基因組中的平均讀序深度。當(dāng)用Illumina等短讀序技術(shù)測定插入DNA和側(cè)翼區(qū)的序列時(shí)，最小讀序深度不應(yīng)低于40 bp。

申請者需提交壓縮(比如gzip)FASTQ格式的原始NGS讀序，采用Sequence Alignment/Map(SAM)格式、Binary Alignment/Map(BAM)格式或CRAM格式提交經(jīng)過比對/匹配后用于生成最終轉(zhuǎn)化體序列的序列，最終轉(zhuǎn)化體序列必須提交電子版的ASCII文本文件，格式可以為EMBL/GenBank或NCBI’s Sequin(ASN.1)格式。

另外，此指導(dǎo)文件還對測序技術(shù)用于分析不同分子特征提出了不同的要求：①當(dāng)分析DNA插入序列的側(cè)翼序列時(shí)，如果申請者此前已向歐盟委員會(huì)(EFSA或EURL-GMFF)提交過轉(zhuǎn)化體的序列，則申請時(shí)必須將正在評估的GM轉(zhuǎn)化體的序列與所有之前提交過的該轉(zhuǎn)化體的序列進(jìn)行比對。申請者必須提供包括所有那些序列在內(nèi)的比對結(jié)果，并報(bào)告所發(fā)現(xiàn)的差異，同時(shí)探討出現(xiàn)差異的原因。申請者必須詳細(xì)描述和解釋所用的方法，提供測序深度信息并說明理由。②當(dāng)分析DNA插入的拷貝數(shù)時(shí)，可以用接頭序列分析(junction sequence analysis, JSA)的方法，需要對任何丟棄的接頭讀序進(jìn)行解釋說明，需要提供讀序深度的詳細(xì)信息。③當(dāng)分析遺傳穩(wěn)定性時(shí)，可以通過比對基于測序的讀序(或重疊群)與插入DNA及側(cè)翼區(qū)的序列來實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。對于包含多個(gè)轉(zhuǎn)化體的GM植物，應(yīng)證明復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物中每個(gè)轉(zhuǎn)化體的完整性。

4.2 加拿大在轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中對提交基因組測序數(shù)據(jù)的要求

2017年，針對全基因組測序在轉(zhuǎn)基因分子特征中的應(yīng)用，加拿大公布了《提交全基因組測序(WGS)數(shù)據(jù)支持新型食品、新型飼料及新性狀植物上市前評估指南》(簡稱《指南》)。《指南》指出，申請者可以只提交用傳統(tǒng)方法獲得的數(shù)據(jù)，也可在此基礎(chǔ)上增加與分子表征有關(guān)的WGS數(shù)據(jù)。此《指南》是首個(gè)針對提交WGS數(shù)據(jù)支持轉(zhuǎn)基因植物上市前評估的文件(https://www.canada.ca/en/health-canada/services/food-nutrition/legislation-guidelines/guidance-documents/guidance-submit-wgs-data.html)。《指南》要求，申請者應(yīng)對WGS研究的目的、原理、實(shí)驗(yàn)方案、DNA樣品制備、測序儀品牌和型號、分析軟件和版本以及所帶軟件的版本等進(jìn)行詳細(xì)描述。如果試驗(yàn)設(shè)計(jì)用到對照，應(yīng)說明與對照有關(guān)的信息。

WGS數(shù)據(jù)分析應(yīng)包括如下內(nèi)容：數(shù)據(jù)處理過程；數(shù)據(jù)質(zhì)量報(bào)告(即FASTQC)，應(yīng)提供基本的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，如讀序長度范圍、讀序次數(shù)、GC含量等，以及顯示量化總體數(shù)據(jù)質(zhì)量的指標(biāo)的圖表；數(shù)據(jù)處理軟件，如果申請者開發(fā)了新的計(jì)算軟件，應(yīng)包含該軟件的驗(yàn)證研究；每一步數(shù)據(jù)分析的目的，并提供每個(gè)計(jì)算步驟中的參數(shù)選擇理由；說明分析中的每一步所獲得的結(jié)果，如果使用了參考序列來匹配所讀取的轉(zhuǎn)化體基因組序列，申請者應(yīng)明確所用的參考品種并說明理由。

5 我國轉(zhuǎn)基因作物安全評價(jià)中采用高通量測序數(shù)據(jù)的建議

綜上所述，高通量測序技術(shù)具有通量高、成本低、標(biāo)準(zhǔn)化、精確度高等特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因生物分子特征解析中得到應(yīng)用，并且測序數(shù)據(jù)已被美國、歐盟、加拿大等國家認(rèn)可用于轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)。當(dāng)前，在國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)的多年資助下，我國復(fù)合性狀、RNAi、基因編輯等新型轉(zhuǎn)基因作物不斷涌現(xiàn)，給轉(zhuǎn)基因作物分子特征解析技術(shù)帶來了新的挑戰(zhàn)。將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于我國轉(zhuǎn)基因生物分子特征解析，并在轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)接受測序數(shù)據(jù)是必然趨勢。為保證測序數(shù)據(jù)在我國轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中應(yīng)用的科學(xué)有效性，吸取其他國家的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，對高通量測序技術(shù)在我國轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中的應(yīng)用提出幾點(diǎn)建議： ①制定高通量測序技術(shù)在我國轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范，對數(shù)據(jù)質(zhì)控要求、測序覆蓋度、提交的數(shù)據(jù)類型及格式、數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式等進(jìn)行明確規(guī)定。②采取個(gè)案分析原則。對數(shù)據(jù)要求、測序深度等的要求不應(yīng)統(tǒng)一要求，而應(yīng)根據(jù)測序的目的、轉(zhuǎn)基因作物的類型、轉(zhuǎn)基因作物受體基因組大小等進(jìn)行具體情況具體分析。個(gè)案分析原則也是當(dāng)前我國轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)中一直遵循的主要原則之一。③任何技術(shù)都有其自身的特點(diǎn)和適用范圍，相互之間是相輔相成的，不存在相互替代的問題。同理，高通量測序技術(shù)獲得的分子特征數(shù)據(jù)與Southern雜交、染色體步移等常規(guī)技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)之間是相互驗(yàn)證和補(bǔ)充的關(guān)系。因此，在轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)過程中，可以只提供Southern雜交結(jié)果，高通量測序數(shù)據(jù)可以作為輔證。當(dāng)Southern雜交不能明確轉(zhuǎn)化事件的分子特征時(shí)，也可以只提供高通量測序數(shù)據(jù)。

6 結(jié)語

高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)分析方法相比，具有通量高、標(biāo)準(zhǔn)化、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻等作物分子特征解析方面已得到應(yīng)用，已成為轉(zhuǎn)基因作物分子特征解析的有效方法之一。

當(dāng)前，生物技術(shù)發(fā)展迅猛，基因編輯、RNAi、mRNA、復(fù)合性狀等新型轉(zhuǎn)基因作物不斷涌現(xiàn)，Southern雜交、染色體步移技術(shù)等傳統(tǒng)分析方法難以正確解析這些新型轉(zhuǎn)基因作物的分子特征。高通量測序技術(shù)能夠精確獲得DNA序列信息，在解析這些新型轉(zhuǎn)基因作物分子特征方面具有明顯的優(yōu)勢，相信伴隨測序技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序技術(shù)在解析轉(zhuǎn)基因作物分子特征方面將發(fā)揮更大的作用，具有良好的應(yīng)用前景。