采收成熟度對雪茄煙葉晾制過程酶促棕色化反應及品質的影響

趙松超, 田培, 劉博遠, 李一凡, 趙銘欽*

(1.河南農業大學煙草學院, 鄭州 450002; 2.海南省煙草公司儋州公司, 海南 儋州 571700)

雪茄作為一種特殊的煙草制品，全部都是用煙葉卷制而成[1]，具有勁頭大，煙味濃，焦油含量少等特點[2]，相較于烤煙,雪茄煙葉的顏色趨于褐色，而煙葉調制是進行酶促棕色化反應改變煙葉外觀顏色的關鍵步驟，適度的酶促棕色化反應有利于提升晾曬煙葉的品質，改善煙葉顏色[3]。因此研究雪茄晾制過程中酶促棕色化反應對煙葉品質提升有重要意義。劉國順等[4]認為煙葉在調制過程中失水速率隨成熟度的提高而加快。王傳義等[5]研究表明,多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性在調制過程中隨成熟度提高而降低。較高的多酚含量有利于提高煙葉的品質[6]，多酚在煙葉調制過程中易被多酚氧化酶等氧化為醌，而醌又經過一系列反應變為褐色物質，但是被氧化較多則容易使煙葉發黑，嚴重影響煙葉品質[7]。煙葉生長過程中不同成熟度的化學成分是不同的[8]，因此不同成熟度的煙葉在晾制后化學成分也是有差異的。

目前，在烤煙方面不同成熟度調制對烤煙的生理變化和品質的研究較多[9-11]，而在雪茄方面卻鮮有報道。海南五指山(N18°52′32″)與古巴的緯度(N21°56′22″)相近，氣候條件相似，是生產優質雪茄煙葉的地區。因此本試驗地選址在海南五指山，調制過程中通過設計不同成熟度雪茄煙葉，研究不同成熟度晾制對雪茄煙葉酶促棕色化反應及其化學成分的影響，旨在為雪茄煙葉的調制提供理論價值和應用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年在海南省五指山市番陽鎮(N18°52′32″，E109°23′32″)進行，該地區土壤為紅色沙壤土質，堿解氮63.16 mg·kg-1，速效磷26.27 mg·kg-1，速效鉀124.61 mg·kg-1，pH為5.9。試驗品種為雪茄H382。

1.2 試驗設計

該品種于2018年2月22日移栽，種植行距為110 cm，株距為45 cm，種植面積為6.8 hm2，施用煙草專用復合肥(N:P2O5:K2O=1∶1∶2)(湖北香青化肥有限公司)，施用量為820 kg·hm-2，采用條施，基追肥比6∶4，基肥施用量為492 kg·hm-2，追肥施用量328 kg·hm-2。施用基肥時，在移栽行將肥料施入并覆土；施追肥時將其溶于水中，在兩株煙株間挖15 cm深度的坑，將溶于水的肥料注入并覆土。大田管理如中耕、培土等措施同當地常規水平一致。采收時選取大田煙株長勢基本一致、葉片大小相對一致的煙株，以中部葉(第11～12葉位)為試驗材料，設置3種采收成熟度即尚熟(M1)、適熟(M2)、過熟(M3)。具體試驗設計及外觀特征見表1。將采摘后的煙葉編桿掛入晾房，晾房規格為30 m×10 m×6 m(長×寬×高)，材料為苫布，掛桿可用長度為300 cm，每桿掛120片煙葉，每個處理標記30桿煙葉作為測試煙樣，相鄰掛桿間距為20 cm，采用當地晾制工藝自然晾制法晾制：晾制前期將煙葉掛于晾房下部，在低溫高濕條件下進行晾制，晾制第11 d時即變黃，末期將煙葉掛于晾房上部，使煙葉在高溫低濕條件下定色干筋。

表1 不同成熟度試驗設計Table 1 Test designation of different maturities

1.3 測定項目及方法

1.3.1溫濕度測定 在晾制開始時將testo184T1型溫濕度自動記錄儀(德國testo公司)懸掛于晾房前中后和上下部位，共懸掛6個，晾制過程中每天在8:00—16:00之間每2 h記錄一次溫濕度：前11 d記錄晾房下部3個溫濕度計的讀數，11 d之后記錄晾房上部3個溫濕度計的讀數，3個讀數作為3次重復。

1.3.2含水率測定 從晾制開始每隔5 d隨機選取晾制中各處理的3種成熟度煙葉，除去整片煙葉靠近葉尖1/3和靠近葉基部1/3，留取中間部分采用加熱烘干法測定煙葉中的含水率[12]，每個處理3次重復。

1.3.3酶活性測定 從晾制開始每隔5 d隨機選取晾制中各處理的3種成熟度煙葉，除去整片煙葉靠近葉尖1/3和靠近葉基部1/3，留中間部分采用比色法測定多酚氧化酶活性[13]，每個處理3次重復。

1.3.4多酚類物質測定 從晾制開始每隔5 d隨機選取晾制中各處理的3種成熟度煙葉，將其烘干磨碎，過60目篩，采用2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)測定煙葉中的綠原酸、蕓香苷和莨菪亭含量[14]，每個處理3次重復。

1.3.5品質指標 晾制結束后，取各處理晾后樣各1 kg，將其烘干磨碎，過60目篩，采用連續流動分析法測定其常規化學成分[15]，每個處理3次重復。

1.4 數據分析與處理

采用Mircosoft Excel 2016軟件進行數據分析及作圖，SPSS 21.0進行顯著性分析及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 晾制過程中溫濕度的變化

晾制過程中晾房內溫濕度的動態變化結果見圖1，可以看出在晾制過程中溫度是逐漸升高的，濕度先上升后下降。晾制前期由于晾房內裝上煙葉，其晾房內部通風變差，再加上煙葉的呼吸代謝放熱[16]，溫度逐漸升高，此時期由于煙葉失水，晾房內相對濕度增大，而隨著溫度的升高，相對濕度上升一段時間后開始逐漸下降，晾制第10 d溫度上升30.7%，濕度上升17.6%。第11 d之后將煙葉掛于晾房上部，煙葉所處的環境溫度升高，濕度降低。

2.2 晾制過程中含水率的變化

不同成熟度煙葉晾制過程中含水率變化結果見圖2，可以看出不同處理煙葉含水率變化規律相似，均隨著晾制的進行而逐漸減小，且都在晾制第10 d之后快速減小。從晾制開始至晾制第10 d期間各處理含水率下降速率相對較小，同一時間點的含水率大小表現為M1>M2>M3，其中M3處理在第5 d時含水率減小較多，且與M1和M2的差異達到顯著水平(P<0.05)，說明M3在第5 d時已經開始大量失水，而M1和M2含水率變化較小，且兩個處理間差異不顯著(P>0.05)，但在第10 d和第15 d時M1和M2差異達到顯著水平(P<0.05)。第11 d時將煙葉掛于晾房頂部，煙葉所處環境由低溫高濕變為高溫低濕，開始大量失水，此過程3個處理煙葉含水率仍以M1最高，M3最低。第25 d時各處理間差異不顯著(P>0.05)，M1、M2和M3含水率分別下降87.6%、85.1%、87.6%。結果說明M3過熟處理的煙葉晾制過程中水分損失較快。

2.3 晾制過程中多酚氧化酶活性變化

雪茄煙葉晾制過程的多酚氧化酶活性結果見圖3，可以看出不同成熟度雪茄煙葉在晾制期間均呈現出單峰的變化趨勢。在晾制過程中PPO活性始終表現為M1>M2>M3，在第0～10 d各處理PPO活性均處于上升趨勢，在第10 d活性達到最大，此時M1、M2和M3處理的酶活性分別升高了94.2%、86.8%和55.3%，期間以M3最低，與M1和M2達到顯著差異水平(P<0.05)，而M1和M2的 PPO活性在晾制5 d之后有顯著差異(P<0.05)。在晾制第10～25 d PPO活性處于下降趨勢，20 d之后各處理PPO活性差異不顯著(P>0.05)，第25 d時M1、M2和M3分別下降92.9%、92.4%和91.6%。

2.4 晾制過程中多酚含量的變化

綠原酸、蕓香苷和莨菪亭作為多酚類物質中重要的酚類，其在煙草酚類物質中含量在80%以上[17]。因此在雪茄煙葉晾制過程中通過測定綠原酸、蕓香苷和莨菪亭3種酚類物質的含量來代表多酚。從圖4可以看出，整個晾制過程中3種酚類物質均以M2處理含量最高。

綠原酸含量在晾制過程中表現出先稍微升高后下降的趨勢，第0～5 d之間，3個處理煙葉的綠原酸含量均稍微增加，其中以M2含量最高，與M1和M3差異達到顯著水平(P<0.05)，但M1與M3差異不大；在第5～10 d之間綠原酸下降速率較快，M1、M2和M3分別下降78.9%、66.0%和66.4%，期間仍以M2含量最高；晾制10 d之后開始緩慢下降，其中緩慢下降過程中M2含量最高，與M1和M3差異達到顯著水平(P<0.05)，而M1和M3處理在晾制20 d之后沒有顯著差異，晾制25 d時M2含量最高，為1.958 mg·g-1。

蕓香苷含量在晾制期內變化趨勢與綠原酸相似，但與綠原酸變化趨勢不同的是，蕓香苷升高后一直呈現出緩慢下降的趨勢。在晾制開始至晾制第5 d之間的上升階段，蕓香苷均以M2含量最高，M1和M3差異不顯著(P>0.05)；在晾制第5～20 d期間，3個處理的蕓香苷含量為M2>M1>M3，且各處理間差異均達到顯著水平(P<0.05)，25 d時蕓香苷含量仍為M2>M1>M3，但M1與M2相差不大，此時M1、M2和M3的蕓香苷含量與開始相比分別下降46.0%、50.0%、62.6%。莨菪亭含量變化趨勢與蕓香苷相同。結果說明，M2適熟處理的煙葉晾制后多酚含量較高，適熟有利于提高多酚含量積累，而尚熟有利于減少多酚的下降比率。

2.5 酶促棕色化反應相關指標的相關性分析

由于酶促棕色化反應主要是多酚氧化酶與多酚類物質的反應[18]，根據PPO活性與多酚含量的變化，將晾制20 d之前的3個處理的酶促棕色化反應指標進行相關性分析，結果見表2。可以看出，各處理的綠原酸、蕓香苷和莨菪亭3種多酚含量均與PPO活性呈現負相關，說明PPO是多酚氧化的關鍵酶；其中3種成熟度處理的綠原酸變化與PPO活性均呈現出顯著負相關性，而蕓香苷和莨菪亭含量與PPO活性的相關性沒有達到顯著水平，由此可以推測出PPO的氧化底物主要是綠原酸，即PPO催化的褐變底物以綠原酸為主，這與北京植物研究所鴨梨黑心病研究小組[19]研究結果一致。蕓香苷含量與莨菪亭含量雖然在M2與M3處理中均達到顯著正相關，但目前所知兩者之間不存在有意義的關系，尚需進一步研究。

表2 不同成熟度晾制中酶促棕色化反應相關指標的相關性Table 2 The correlation analysis of related metrics enzymatic browning reaction index in different maturities during air curing

2.6 晾制成熟度對雪茄煙葉化學成分的影響

不同成熟度煙葉晾制的化學成分含量結果見表3，可以看出各處理總糖和煙堿含量差異較大，總糖含量以M2處理煙葉較高，為1.97%；煙堿含量隨成熟度的提升而增加，煙葉成熟度從尚熟到過熟其煙堿含量從2.39%增大至3.18%，增幅為33.1%；鉀含量M3較低，為3.41%，與M1和M2差異顯著；還原糖含量為0.81%～1.47%，M2最高，為1.47%，與M1和M3差異顯著，分別為M1和M3的1.56倍和1.82倍。根據優質煙葉標準[20]即還原糖含量16%～20%，總糖含量18%～22%，煙堿含量2%～3%，兩糖比≥0.9，鉀氯比≥4，該試驗中各處理總糖含量和還原糖含量與烤煙相比普遍偏低，這是因為雪茄晾制時間較長，在此過程中煙葉的微生物進行生命活動消耗了糖類物質[21]，且煙葉自身也消耗了糖類，但相對來說以適熟煙葉的總糖含量和還原糖含量較高。而M3處理煙堿含量較高，兩糖比適熟煙葉較好。綜合來看，化學成分以適熟煙葉協調性較好，尚熟煙葉次之。

表3 不同成熟度的中部雪茄煙葉化學成分Table 3 Chemical composition of middle cigar tobacco leaves with different maturities

3 討論

水分是細胞生命活動的基礎，在細胞代謝過程中扮演重要的角色，在一定范圍內，水分的多少直接影響著細胞生命活動的強弱[22]。在成熟期，隨著煙葉成熟度的提高，煙葉組織越來越疏松，而疏松的煙葉組織失水速率較緊密的煙葉組織快[23]。在本試驗中，由于不同成熟度雪茄煙葉組織緊密度不同導致3個處理在整個晾制期間含水率大小始終表現為尚熟>適熟>過熟。在晾制10 d之前，由于各處理煙葉所處環境溫度較低濕度較高，煙葉失水速率較慢，但在晾制第10 d后煙葉含水率迅速下降，這是因為在晾制10 d后煙葉所處環境的溫度升高、濕度降低所致。

PPO是煙草中一種重要的酶類，主要存在于葉綠體中[24]，是酶促棕色化反應的直接介導物，適當提升PPO活性有利于晾曬煙的品質[18]，調制過程中其活性大小的一個重要限制因素是煙葉含水率，煙葉含水率越高，PPO活性也就越高[25]。本試驗中，3個成熟度處理的煙葉含水率差異致使晾制期間PPO活性大小始終表現為尚熟>適熟>過熟。晾制過程中，PPO活性逐漸升高可能是因為隨著煙葉水分的流失，膜系統逐漸被破壞[26]，酶與底物更加充分地接觸導致，也可能是隨著晾制的進行，溫度逐漸升高，酶活性也隨之升高[27]。第10 d之后，煙葉所處環境溫度升高，濕度降低，煙葉開始大量失水，從而導致酶活下降，此時尚熟煙葉中水分含量最高，因此，PPO活性以尚熟煙葉最高，之后晾房內溫度持續升高，晾房內相對濕度和煙葉水分繼續減少，PPO活性也隨之減小。由于過高的PPO活性容易導致煙葉發黑、霉變，嚴重影響煙葉的品質[27]，適熟煙葉中PPO活性，更利于雪茄煙葉品質的提升。

多酚作為煙草中的重要化學物質，其含量對煙草品質有重要影響[28]。煙葉生長過程中，隨著成熟度的提升多酚含量先升后降，因此本研究中適熟煙葉晾制開始時適熟煙葉多酚含量最高。本研究發現多酚含量在晾制過程中先增加后下降，增加可能是由于煙葉內的熱解物如木質素等的熱解轉化作用導致[29]。之后綠原酸在多酚氧化酶作用下下降，而煙葉失水較快會導致細胞膜系統的破壞，使氧自由進入細胞內將綠原酸氧化[30-31]，本研究發現綠原酸含量適熟煙葉中最高，說明適熟煙葉有利于綠原酸含量的積累。10 d之后多酚氧化酶活性下降，綠原酸含量下降速率也變得較為緩慢，此時各處理煙葉失水較為嚴重，在多酚氧化酶和氧的作用下，綠原酸仍處于下降趨勢。綠原酸作為酚類物質的主要成分，其含量的變化對煙葉質量的影響尤為重要[32]，而多酚含量與多酚氧化酶活性相關性分析說明綠原酸含量的變化主要是由多酚氧化酶活性決定的。由于多酚氧化酶主要氧化綠原酸，因此蕓香苷和莨菪亭在多酚氧化酶活性較高的期間沒有明顯下降趨勢，均呈現出先升高后緩慢下降的單峰趨勢。晾制5 d之后各處理煙葉失水導致氧進入細胞氧化蕓香苷和莨菪亭，因此蕓香苷和莨菪亭含量開始下降，由于不同成熟度煙葉水分含量變化，適熟與尚熟煙葉兩種多酚含量較高。雪茄晾制時間較長，綠原酸、蕓香苷和莨菪亭被氧化較多，這也是雪茄顏色呈褐色的主要原因之一，但是多酚被氧化較多不利于煙葉顏色的定型，也不利于煙葉內在品質的提升。因此，綜合考慮本試驗中適熟煙葉晾制有利于雪茄煙葉品質的提升，未熟煙葉次之。

在煙葉生長過程中，隨著成熟度的提高，其內在化學成分也會隨之變化[33]。煙堿是煙草的重要含氮化合物，主要在煙株根系中合成，并被運輸到煙葉中[34-35]，煙株在成熟過程中其根系一直具有活力[36]，因此煙株能繼續從土壤中吸收氮素合成煙堿并輸送至煙葉，而過熟煙葉采摘時間較晚，其煙葉內積累的煙堿較多，適熟煙葉次之，尚熟煙葉最低。本研究中，總糖和還原糖含量均以適熟煙葉最高，可能是由于適熟煙葉中淀粉含量較多且在晾制過程中適熟煙葉晾制特性較好，淀粉易降解，晾制結束后淀粉降解量最大，因此產生的糖較多[37-39]。研究發現，隨著成熟度的提高，煙葉鉀含量逐漸減小，可能是因為煙葉成熟時，鉀離子會向其他部位轉移，煙葉衰老時，鉀離子則損失較大，因此過熟煙葉中鉀離子較低[40]。結果表明，在該試驗的3個不同成熟度處理中，以適熟煙葉中的化學成分較為協調，未熟煙葉次之。

綜合來看，采收成熟度對煙葉晾制過程中含水率、多酚氧化酶活性、多酚含量和化學成分都有顯著影響，適熟煙葉有利于酶促棕色化反應的進行，提高煙葉的晾制品質。因此，在海南五指山地區采收適熟雪茄煙葉進行晾制可有效提高酶促棕色化反應對雪茄煙葉的有利影響，為地區雪茄煙葉晾制提供理論價值和應用參考，也可稍微降低煙葉成熟度采摘。