Bispora sp. MEY-1 來源嗜酸果膠甲酯酶性質分析及其應用研究

王志云, 羅會穎, 姚斌, 徐波, 涂濤*

(1.江西農業大學生物科學與工程學院, 南昌 330045;2.中國農業科學院飼料研究所, 農業農村部飼料生物技術重點實驗室, 北京 100081)

果膠低聚糖(pectin oligosaccharide，POS)又稱為果膠寡糖，是果膠物質經過解聚反應后產生的具有多種生理功能的低分子質量寡糖產物，以半乳糖醛酸為基本單元，通過α-1, 4糖苷鍵連接形成，聚合度一般介于2～18，分子量介于200～2 000 Da[1]。目前果膠低聚糖一般通過天然原料中分離、人工合成以及果膠降解等方法獲得。工業生產中，常以柑橘皮、蘋果渣、甜菜渣、山楂渣等富含果膠的農業食品廢棄物為原料，通過化學方法、物理方法和生物酶法將果膠降解以獲得果膠低聚糖[2]。通過果膠酶酶解果膠原料既可以實現對農業食品廢棄物的再利用，減少資源浪費，同時又產生不同結構和聚合度的果膠寡糖[3]，創造新的經濟價值。

內切多聚半乳糖醛酸酶通過對底物鏈隨機切割，產生單糖、二糖和三糖，不僅可以有效降解果膠為低聚糖[4]，也可以避免物理方法和化學方法在聚合度和結構類型方面難以控制的問題。但是由于農業食品廢棄物中果膠來源和種類非常復雜，天然果膠一般包含高酯果膠和低甲氧基果膠(low-methoxyl pectin)，而且不同來源的果膠其甲基化程度往往不同，蘋果的甲基化程度高達57%，沙棘、梨、豌豆、韭菜葉子和新鮮南瓜中的甲基化程度分別是32%、30%、28%、25%和18%[5]。而已有研究報道，內切多聚半乳糖醛酸酶水解能力因半乳糖醛酸分子上甲酯化程度的增高而降低[6]。PG8fn是來源于Achaetomiumsp. Xz8的典型的GH28 家族的高比活內切多聚半乳糖醛酸酶，能夠特異性地水解多聚半乳糖醛酸產生半乳糖醛酸、二聚半乳糖醛酸以及三聚半乳糖醛酸等果膠低聚糖產物[7]。利用內切多聚半乳糖醛酸酶PG8fn與果膠甲酯酶協同降解果膠原料可以從食品加工副產物中高效獲取低酯果膠低聚糖。

果膠甲酯酶(pectin methylesterase)屬于羧酸酯水解酶。大多存在于植物組織中，廣泛存在于胡蘿卜、番茄、馬鈴薯、臍橙、蘋果、番木瓜以及葡萄等植物中，在曲霉、假單胞菌和芽孢桿菌中也有報道。目前研究的果膠甲酯酶適應pH范圍較為廣泛，有酸性、中性和堿性三類，大多數植物來源的果膠甲酯酶的最適pH及其等電點都偏中性或堿性[8-10]，理論分子量集中在20～40之間。而真菌來源，如來源于黑曲霉的果膠甲酯酶，一般是嗜酸性的[11-12]。嗜酸真菌Bisporasp. MEY-1 能分泌產生多種重要的工業用酶，其中包括木聚糖酶[13]、β-葡聚糖酶[14]、半乳糖苷酶[15]、果膠酶[16]等。本研究從嗜酸真菌Bisporasp. MEY-1基因組成功克隆了一個果膠甲酯酶基因，并命名為Pem8A，在畢赤酵母中成功高效表達，并進行了酶學特征的研究，對其在食品加工副產物中的再利用進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及試劑

Bisporasp. MEY-1分離自江西省山南“721礦”的鈾礦廢水。大腸桿菌Trans1-T(TransGen，北京，中國)和畢赤酵母GS115(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分別用于DNA測序和異源表達宿主。 pEASY-T3(TransGen)和pPIC9(Invitrogen)質粒分別用作基因克隆和表達載體。試驗所用的總RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒分別購自Promega(Madison, Wisconsin, USA)和TOYOBO(Osaka, Japan)；高保真DNA聚合酶Fastpfu Fly購自北京全式金生物技術有限公司(北京，中國)；質粒提取試劑盒購自Omega(Norcross, Georgia，USA)，T4 DNA連接酶和限制性內切核酸酶均購自TaKaRa (Otsu, Japan)。酯化程度為50%～70%的橘皮果膠來自Sigma(San Diego, CA, USA)，用于果膠甲酯酶酶活測定。其他常見化學試劑均為分析純，購自西隴科學股份有限公司。

1.2 培養基配制

試驗中所用培養基有誘導培養基(0.5% (NH4)2SO4, 0.1% KH2PO4, 0.05% KCl, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.01% CaCl2, 1.0%果膠)、馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)、LB液體培養基、LB固體培養基、MD固體培養基、BMGY培養基、BMMY培養基和YPD培養基[17]。

1.3 基因序列信息的獲取及分析

根據Bisporasp. MEY-1的全基因組測序結果，查找到一個8家族果膠甲酯酶基因，命名為Pem8A，并對該基因進行生物信息學分析。將果膠甲酯酶Pem8A的基因序列通過BLASTx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源序列檢索，從而對該基因的新穎性進行評估，通過Signal P 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對N-末端信號肽進行預測，NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetOGlyc 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)預測可能的N-糖基化和O-糖基化位點。利用Vector NTI Advance 11.5軟件將基因序列翻譯成氨基酸序列后，用于預測的分子量和理論等電點。用Discovery Studio 2017(Accelrys，USA)軟件進行同源性建模。

1.4 果膠甲酯酶基因Pem8A的克隆與畢赤酵母表達載體構建

為了誘導果膠甲酯酶產生，將Bisporasp. MEY-1 菌株接種在含有1.0%果膠的誘導培養基中，并于 30 ℃下200 r·min-1震蕩誘導培養3 d。收集峰值時期的菌絲，置于預冷的滅菌研缽中，立即倒入液氮研磨至粉末狀。采用RNA分離系統提取菌絲總RNA，然后參照ReverTra Ace-a-TM kit反轉錄試劑盒方法，將RNA反轉錄合成cDNA。設計分別含有EcoRI和NotI酶切位點的引物(Pem8AF：5’-CGGAATTCATGAAAGCAT-TCGATTTCCTCACTTGCGCGT-3’，Pem8AR：5’-CTAACTAAGATATGAGGTATCTACAAACGAGCG-GCCGCAA-3’，其中下劃線處指酶切位點)，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：5×FastpfuFly buffer 10 μL，dNTP 5μL，cDNA 2 μL，引物Pem8AF 1 μL，引物Pem8AR 1 μL，FastpfuFly 1 μL，ddH2O 30 μL，總體積50 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s,30個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.5 果膠甲酯酶基因Pem8A的異源表達及純化

將經測序驗證正確的表達載體pPIC9-Pem8A用限制性內切酶BglⅡ線性化處理后，通過電擊轉入畢赤酵母GS115感受態細胞中，將轉化子涂布組氨酸缺陷型的MD平板于30 ℃培養箱培養3 d，然后挑取96個單克隆菌落于3 mL BMGY液體培養基中培養(30 ℃、250 r·min-1)，培養2 d后4 500 r·min-1離心5 min，棄上清并收集菌體，然后重懸于1.0 mL的BMMY誘導培養基中誘導培養2 d。最后，通過酶活檢測挑選出活性最高的克隆子于1 L搖瓶中進行放大培養。將篩選的高酶活轉化子在YPD培養基中經3 d活化(30 ℃、200 r·min-1)，接種于300 mL BMGY液體培養基中，接種量為1.0%。30 ℃條件下培養72 h后，4 500 r·min-1離心5 min，收集菌體轉入200 mL含有0.5%甲醇的BMMY液體培養基繼續培養48 h，誘導期間每隔12 h補加1.0 mL甲醇，使甲醇終濃度控制在0.5%左右。

誘導結束后，將誘導后的培養液12 000 r·min-1冷凍離心15 min，棄去菌體及其不溶性雜質，用截留分子量為5 kD的Vivaflow 200膜包(Vivascience，Hannover，Germany)超濾濃縮上清液至20 mL，然后于pH 6.0、10 mmol·L-1檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中在4 ℃條件下過夜透析脫鹽處理。將透析處理的酶液通過陰離子交換層析緩沖液過夜透析脫鹽，脫鹽后的粗酶液通過陰離子交換柱(HiTrap Q HP 5 mL FPLC，GE Healthcare, Uppsala, Sweden)系統純化，獲得純化的目的蛋白，所有的純化步驟都在4 ℃條件下執行。取純化后的酶液用Endo H(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)在37 ℃水浴中溫育2 h進行脫N糖基化處理。最后，將純化后的蛋白與去除N-糖基化修飾的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析。

1.6 酶學性質測定

1.6.1果膠甲酯酶PEM8A的活力測定 果膠甲酯酶PEM8A活力測定所使用的底物為酯化程度為50%～70%的橘皮果膠，反應體系為25 mL，質量分數為0.1%的橘皮果膠在終濃度為117 mmol·L-1NaCl條件下，加入1 mL適當稀釋過的酶液，在一定pH和溫度下孵育反應10 min；在孵育反應過程中通過2 mmol·L-1的NaOH對反應體系的pH進行調試，使反應體系的pH和設定值保持一致直至反應停止，通過NaOH緩沖液的補償體積計算酶活，每組3個重復；活性定義為在標準條件下每min釋放1 μmol羧酸，即為一個酶活力單位(U·mL-1)。

1.6.2PEM8A的最適pH測定 選擇50%～70%的橘皮果膠為底物，通過適當稀釋純化后的PEM8A于55 ℃，在不同pH條件(pH 2.5～7.0)下進行酶促反應以測定其酶活力，其中測定酶活最高時對應的pH即為該酶的最適pH。pH 穩定性的測定方法為:將純化的酶液調至pH 2.0～10.0范圍內，37 ℃孵育1 h，然后于pH 3.5條件下60 ℃反應10 min，測定其剩余酶活，計算不同pH處理下的相對剩余酶活。

1.6.3PEM8A的最適溫度測定 選擇50%～70%的橘皮果膠為底物，在pH 3.5條件下，分別在40、50、55、60、65、70、80 ℃溫度條件下測定PEM8A酶活力，其中測定酶活最高時對應的溫度條件即為該酶的最適溫度。將純化的PEM8A分別在55、60和65 ℃條件下孵育2～60 min不等時間，然后測定其剩余酶活。以0 ℃處理的樣品為對照(100%)，分別計算不同溫度不同時間處理后樣品的剩余酶活。

1.6.4不同金屬離子和化學試劑對PEM8A活力的影響 在酶促反應體系中分別加入1.0 mmol·L-1金屬離子及有機溶劑(K+、Ca2+、Co+、Cr2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+、Li+、EDTA、SDS、β-巰基乙醇)研究其對酶活性的影響。在pH 3.5和60 ℃下測定PEM8A活力，以未加金屬離子及有機溶劑酶活力為對照，將其定義為100%。每組試驗設置3個重復。

1.6.5PEM8A的動力學常數測定 選用酯化程度為50%～70%的橘皮果膠，在0.01～1.0 mg·mL-1底物濃度的反應體系和60 ℃、pH 3.5條件下5 min測定酶活，通過GraphPad Prism 5軟件進行數據處理分析，計算其比活、Vmax、Km值。

對于稅負的多少來說，不僅受收入和費用的影響，稅率也是影響其大小的關鍵之一。本次個稅改革，稅率沒有變更，但是稅率級距增加了(如表2所示)。稅率不變，稅率級距的增加則會讓更多的中低收入者的收入劃入稅率較低的檔，從而減少應納個人所得稅額。

1.6.6PEM8A對橘皮、蘋果渣粗提果膠酶活的測定 以質量體積分數為0.1%酯化程度的50%～70%果膠和橘皮、蘋果渣粗提果膠為底物，pH 3.5，60 ℃條件下測量酶活，每個反應體系設置3個重復和空白對照。

1.6.7PEM8A酶與多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的協同作用 首先，在最適條件下對已純化的內切多聚半乳糖醛酸酶PG8fn進行酶活的測定，測定方法為：取100 μL適當稀釋倍數的酶液(200 mmol·L-1Na2HPO4-檸檬酸 Buffer，pH 6.0)于900 μL 0.33%多聚半乳糖醛酸(200 mmol·L-1Na2HPO4-檸檬酸 Buffer，pH 6.0)，45 ℃反應10 min，加入1.5 mL DNS終止反應。以反應結束加入1.5 mL DNS 終止后補加100 μL 稀釋酶液作為對照組，每組3個重復，反應體系在沸水中煮5 min，冰水冷卻后在540 nm下測定OD值，酶活計算方法參考華婷等[18]。

在25 mL質量體積分數0.1%的橘皮、蘋果渣果膠粗提物、終濃度為117 mmol·L-1NaCl的反應體系中加入39.2 U單位的已純化的果膠甲酯酶PEM8A，pH條件為3.5，放置于60 ℃的恒溫水浴震蕩搖床中200 r·min-1分別酶解0、4、8、12、24 h。以處理過的質量體積分數為0.1%的橘皮、蘋果渣果膠粗提物為底物，pH調至6.0，在PG8fn的標準反應體系下分別進行酶活測定，每組3個重復。

2 結果與分析

2.1 果膠甲酯酶基因Pem8A的克隆與序列分析

從嗜酸真菌Bisporasp. MEY-1成功克隆到果膠甲酯酶基因Pem8A，分析可知Pem8A的全長DNA和cDNA序列均為1 002個堿基對，不存在內含子序列。對其編碼的氨基酸序列進行信號肽預測，結果表明，cDNA可編碼316個氨基酸，N端1～18個氨基酸為信號肽序列，成熟肽部分的理論分子量為33.7 kD，預測等電點為3.95。PEM8A的氨基酸序列與來源于Coniellalustricola的果膠甲酯酶的氨基酸序列相似性高達98%。PEM8A與已報道晶體結構的果膠甲酯酶的相似性較高，其中與黑曲霉來源的果膠甲酯酶的晶體結構5C1E的序列相似性高達93%，而與胡蘿卜來源的果膠甲酯酶晶體結構1GQ8的序列相似性為79%。以PDB中ID號為5C1E的果膠甲酯酶晶體為模板對 PEM8A進行同源建模(圖1)，從結構上分析，催化中心包含Gln176、Asp177、Asp198和Arg267，Arg267通過側鏈上的兩個氧原子與Asp198上的氫形成氫鍵，作為親和攻擊的位點，而Asp177在催化過程中起酸堿的作用。谷氨酰胺Gln154和Gln176的側鏈可以形成一個陰離子孔，主要是穩定帶負電荷的甲基化的D-半乳糖醛酸單元(圖1)。

2.2 果膠甲酯酶PEM8A的表達和純化

將誘導獲取的粗酶液進行濃縮純化后，對純化蛋白進行SDS-PAGE電泳驗證，結果(圖2)表明，畢赤酵母表達的果膠酸裂解酶PEM8A的表觀分子量最小，接近37 kD，并且存在3條蛋白條帶，相較預測理論分子量(33.7 kD)更大，分析PEM8A的氨基酸序列，有可能因糖基化造成分子量偏大。通過液相色譜-電噴霧串聯質譜(LC-ESI-MS)對SDS-PAGE分離的PEM8A蛋白條帶進行分析，3條蛋白條帶檢測的肽段分別對應于PEM8A序列(圖2)。其中每個蛋白條帶中均檢測到與目的序列相匹配的氨基酸序列“VETTNFKMYNINVK”和“VLTADLGYITASGR”，其覆蓋度為15.99%，充分證明其為目的蛋白PEM8A。在通過Endo H脫糖基后PEM8A的分子量均明顯變小，但依然比其理論分子量大許多，表明PEM8A除了發生N糖基化，還存在部分O糖基化。網站預測其糖基化修飾位點，發現N糖基化修飾位點分別為N90、N125、N127、N130和N236，O糖基化修飾位點分別為T22、S26、E302、S305和E308。

2.3 PEM8A酶學性質測定

pH、溫度和時間對PEM8A酶活的影響結果(圖3)顯示，PEM8A的最適pH為3.5，整體嗜酸。且在pH 2.5～5.0范圍內，維持50%以上酶活力，pH在7.0基本檢測不到酯酶活性，表明PEM8A是一類嗜酸性酶，在酸性范圍內具有較高酶活性。PEM8A具有很好的pH穩定性，在酸性環境中保持穩定，在pH 2.0～5.0時仍保持88%以上的剩余酶活，在pH 6.0時仍保持60%以上的剩余酶活。

由于全自動電位滴定儀中pH電極的耐受最高溫度為80 ℃，PEM8A的最適溫度為60 ℃，在55～80 ℃有80%左右的相對酶活，但在40 ℃時僅有48%左右的相對酶活，表明PEM8A是一類嗜熱酶。PEM8A具有較好的熱穩定性，55 ℃環境中處理1 h后仍可保持82%的剩余酶活，高度穩定；60 ℃環境中處理30 min，仍有60%的剩余酶活；65 ℃環境中處理30 min，仍有45%的剩余酶活。

2.4 PEM8A的動力學常數測定

PEM8A在pH 3.5、溫度60 ℃，以酯化程度為50%～70%的橘皮果膠為底物的比活為(485.02±10.3) U·mg-1，Vmax值為476.8 μmol·min-1·mg-1，Km值為0.034 mg·mL-1。

2.5 金屬離子及有機溶劑對PEM8A活性的影響

在酶促反應體系中添加不同金屬離子和有機溶劑后PEM8A的酶活結果(表1)顯示，在1 mmol·L-1的終濃度下，Ni2+、Cu2+、Li+、EDTA、SDS和β-巰基乙醇對PEM8A活性具有顯著促進效應，與CK相比，PEM8A活性分別提高58.7%、51.5%、62.3%、57.5%、58.7%和57.0%。K+、Co+、Zn2+對PEM8A的酶活促進效果不顯著。金屬離子Ca2+、Cr2+、Mn2+、Mg2+、Pb2+對PEM8A的酶活具有一定的抑制效果。

表1 不同金屬離子或化學試劑處理對PEM8A活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of PEM8A

2.6 橘皮、蘋果渣果膠的提取率測定

在果膠低聚糖的可能來源中，食品廢棄物是主要的研究對象。近年來，利用農業食品工業中的橘皮和蘋果渣等食品廢棄物獲取果膠低聚糖已經成為一個越來越重要的問題。食品廢棄物橘皮和蘋果渣中果膠的含量結果(表2)可知，砂糖橘皮和蘋果渣的果膠提取率差異較大，蘋果渣的果膠產率僅為3.3%，而砂糖橘皮果膠產率為15.01%。因此，柑橘皮類材料常作為工業上提取果膠的優選原材料。

表2 橘皮、蘋果渣果膠的提取率Table 2 Extraction rate of orange peel and apple pulp pectin

2.7 PEM8A酶對橘皮、蘋果渣粗提果膠酶活的測定

PEM8A對酯化度為50%～70%的橘皮果膠及橘皮、蘋果渣粗提果膠的比活分別為(391.7±4.2)、(276.6±4.1)、(287.8±5.1)U·mg-1(圖4)，表明PEM8A對橘皮、蘋果渣粗提果膠均具有較高的活性，說明PEM8A可以有效降低橘皮、蘋果渣粗提果膠的甲基化。

2.8 果膠甲酯酶PEM8A與多聚半乳糖醛酸酶PG8fn協同降解

在內切多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的最適條件下，以質量體積分數0.33%的多聚半乳糖醛酸為底物測定的PG8fn的比活為(11 005.5±272.8) U·mg-1。對經PEM8A分別酶解0、4、8、12、24 h的蘋果渣、橘皮果膠粗提物進行內切多聚半乳糖醛酸酶PG8fn活性測定，結果(圖5)表明，未經PEM8A處理的果膠中PG8fn活性明顯較低，分別只有(397.2±41.3)、(1 865.0±113.7)U·mg-1，隨著PEM8A對橘皮、蘋果渣果膠粗提物的酶解時間延長，PG8fn的酶活也逐步增高，當PEM8A的處理時間延長至24 h，PG8fn對經PEM8A去甲基化的蘋果渣、橘皮果膠粗提物的酶活分別達到(3 807.4±59.2)和(3 744.4±105.7)U·mg-1，較未處理前分別提高了8.5倍和1倍左右。

3 討論

經過NCBI 基因庫的比對和同源建模驗證，發現來源于Bisporasp. MEY-1的Pem8A是第8家族的果膠甲酯酶基因，與表達質粒pPIC-9r連接后成功在畢赤酵母中表達。經純化后的PME8A分子量大小為37 kD，其比活為(485.02±10.3)U·mg-1，Vmax值為476.8 μmol·min-1·mg-1，Km值為

0.034 mg·mL-1。Xia等[19]和 Zhang等[20]分別實現了產黃青霉和黑曲霉的果膠甲酯酶在畢赤酵母中異源高效表達，搖瓶水平表達量分別為1.09 和77.1 U·mL-1，而TalaromycesleycettanusJCM12802[18]來源果膠甲酯酶在發酵罐水平表達量高達428 U·mL-1。本研究中重組果膠甲酯酶PME8A搖瓶水平表達量為47.2 U·mL-1，其表達量具有一定的優勢，為工業化大規模應用提供了參考。

據報道大多數植物來源的果膠甲酯酶都是中性或堿性的，其最適pH范圍在7.0～9.0之間。如來源于葡萄[21]和刺果番茄枝[22]的果膠甲酯酶最適pH為7.0，來源于臍橙和向日葵花盤的果膠甲酯酶最適pH為7.6和7.5，來源于番茄[23]和大豆細胞壁[24]的果膠甲酯酶最適pH為8.0，來源于柑桔和金尾虎果的果膠甲酯酶最適pH為9.0。而PEM8A是一類嗜酸的果膠甲酯酶，最適pH為3.5，在酸性至中性環境中穩定，在pH 2.0～5.0時仍保持88%以上的剩余酶活。PEM8A成熟肽的預測等電點為3.95，在嗜酸性酶的研究中發現導致該酶嗜酸的原因可能是pI值低和帶負電荷多分布在分子的表面[25]。與堿性果膠甲酯酶結構相比，可知PEM8A在蛋白質表面(Asp118、Asp122、Asp123、Asp152和Glu194)和催化中心分布的帶負電荷氨基酸可能與PEM8A的嗜酸性有關[26]。

真菌來源的果膠甲酯酶大多屬于中溫酶，最適溫度在50～70 ℃之間，如來源于Clostridiumthermocellum的CtPME最適溫度為60 ℃[8]，來源于TalaromycesleycettanusJCM12802的PmeT最適溫度為75 ℃[20]。本研究中,PEM8A最適溫度為60 ℃，屬于中溫型真菌果膠甲酯酶，其有效作用溫度整體偏高，在中溫(40 ℃)環境中也有48%左右的相對酶活，在55～80 ℃的環境中也有80%左右的相對酶活。PEM8A在55 ℃環境中處理1 h后仍可保持82%的剩余酶活，具有較好的溫度穩定性。如來源于Erwiniachrysanthemi3937的PMEA[27]和來源于ErwiniachrysanthemiB374的PME[28]都只能在中低溫下保持穩定。從PEM8A的氨基酸序列分析可知，PEM8A的氨基酸組成中Ser和Thr含量豐富，分別在氨基酸總數中占13.6%和11.4%，Ser和Thr殘基容易發生O糖基化，SDS-PAGE凝膠電泳分析也驗證了O糖基化的存在，而糖基化作用能夠有效穩定蛋白質骨架，增加酶的熱穩定性[29-31]。

目前果膠甲酯酶主要應用在通過提高果粒的硬度來改善果粒飲料的口感[32]，和通過果膠甲酯酶對高酯果膠進行去甲基化來獲取低酯果膠[33]等方面。但是利用果膠甲酯酶對果膠進行去甲基化獲取低酯果膠，再通過內切多聚半乳糖醛酸酶降解低酯果膠來獲取果膠低聚糖的研究較少。本研究中通過極端嗜酸真菌Bisporasp. MEY-1來源的果膠甲酯酶PEM8A對食品加工副產物橘皮和蘋果渣來源的果膠粗提物進行去甲基化處理，再利用來源于Achaetomiumsp. Xz8的典型GH28家族的內切多聚半乳糖醛酸酶PG8fn降解果膠。以蘋果渣和橘皮粗提物為底物，測得PG8fn的活性較低，分別只有(397.2±41.3)和(1 865.0±113.7)U·mg-1，是因為蘋果渣和橘皮來源的果膠都有不同程度的甲基化，而內切多聚半乳糖醛酸酶僅能裂解游離的聚半乳糖醛酸卻不能裂解甲基化的底物[34]。通過PEM8A降解果膠中的甲基，隨著PEM8A反應時間的延長，PG8fn酶活力逐步增加。PEM8A的處理時間延長至24 h時，相較未處理前，蘋果渣和橘皮粗提物中的PG8fn酶活分別提高了8.5倍和1倍。結果表明，PEM8A對橘皮、蘋果渣果膠粗提物具有顯著的去甲基化作用，能夠為內切多聚半乳糖醛酸酶PG8fn進一步水解果膠來獲取果膠低聚糖過程中去除甲基化帶來的影響。