鉤狀木霉在辣椒根際定殖動態及其對辣椒疫病的生物防治

趙興麗， 陶剛， 婁璇， 顧金剛

(1. 貴州省農業科學院生物技術研究所，貴陽 550006; 2. 貴州民族大學生態環境工程學院，貴陽 550025; 3. 貴州省農業科學院, 貴州省農業生物技術重點實驗室，貴陽 550006; 4. 貴州師范大學生命科學學院，貴陽 550000; 5. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，中國農業微生物菌種保藏管理中心，北京 100081)

辣椒是我國重要的經濟作物，全國辣椒種植面積200萬 hm2，產量達到4 000萬t，產值超過700 億元，占蔬菜種植面積12%以上[1]。辣椒疫病主要是由辣椒疫霉 (Phytophthoracapsici)引起的毀滅性真菌病害[2]。辣椒疫霉主要以卵孢子和厚垣孢子的形式在植物種子、土壤和宿主植物的病殘體中越冬，當溫度與濕度適宜時萌發，侵染植物致其發病死亡[3]。辣椒疫病多發生在辣椒現蕾掛果時期，田間擴展迅速，常造成大面積成片死亡[4]。目前，辣椒疫病防控仍以化學防治為主，如甲霜靈、精甲霜靈等苯酰胺類殺菌劑能夠有效防治辣椒疫病[5]，但化學藥劑的使用使辣椒疫霉菌逐步產生一定程度的抗藥性[6-7]。

近年來，許多研究表明，多種生防菌對辣椒疫病具有生物防治作用，包括木霉菌(Trichodermaspp.)、叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等[8-10]。辣椒疫病的生物防治主要是指利用微生物抑制辣椒疫霉的活性及繁殖能力，甚至殺滅病原菌的方式，來減輕和防治辣椒疫病的發生[11]。生防菌通過與病原菌競爭營養和生存空間，調節宿主內源激素平衡促進植株生長，提高宿主防御酶活性，誘導病程相關蛋白表達，產生次級代謝物及抗生素，改變宿主根系形態結構，使宿主通過有效阻擋病原菌侵入等方式防治植物病害的發生[12]。木霉菌是一類自然界廣泛分布的真菌資源，很多種類對植物病害具有重要的生物防治作用。研究表明，木霉菌至少對l8個屬29余種病原真菌和多種病原細菌有拮抗作用[13-15]。其中，在辣椒疫病生物防治方面，許多木霉種類，如棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、鉤狀木霉(Trichodermahamatum)和俄羅斯木霉(Trichodermarossicum)能通過重寄生或產生揮發性和非揮發性抑菌化合物抑制辣椒疫霉的生長[16-19]；劉青等[20]從腐木和土壤中分離得到綠色木霉(Trichodermavirens)、棘孢木霉(T.asperellum)、鉤狀木霉(T.hamatum)與哈茨木霉(Trichodermaharzianum) 4個種的11株木霉菌株都能對辣椒疫霉菌有一定程度的抑制作用。生防菌定殖能力的強弱是評價其生防潛力的重要指標[21-22]。木霉菌生防作用的實現，在很大程度上取決于木霉在繁殖階段與棲居微生物的競爭能力，較強的吸附和繁殖能力是木霉競爭其他微生物的決定因素。進行強定殖能力的菌株篩選或者采用分子生物學技術有目的地增強木霉在植物表面或內部的定殖能力，可以有效提高木霉的生物防治能力和促生效果[23]。

本研究以鉤狀木霉菌ACCC31649為試驗材料，在本實驗室前期綠色熒光蛋白(GFP)標記該菌株的基礎上，構建鉤狀木霉(ACCC31649-GF21)GFP標記真菌、辣椒及其重要土傳病害辣椒疫病菌(P.capsici)的三者互作體系，結合平板拮抗試驗和溫室盆栽試驗，研究鉤狀木霉菌在辣椒植株及根際中的定殖能力，以及對辣椒疫病的生物防治效果，為木霉菌生防機理研究和生防菌劑的開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鉤狀木霉菌株(T.hamatum) ACCC31649由中國農業科學院農業微生物菌種保藏中心提供；ACCC31649-GF21由貴州省農業科學院植物保護研究所生防研究室進行GFP標記并保存[24]；辣椒疫霉菌(P.capsici)由中國農業科學院農業微生物菌種保藏中心提供；供試辣椒品種‘極品青龍’為感辣椒疫病品種，種子由海南昊豐實業有限公司生產。

PDA培養基：200 g土豆放入1 000 mL水中煮30 min過濾，定容至1 000 mL，加入瓊脂粉15～20 g，葡萄糖20 g，自然pH；PDB液體培養基：未加瓊脂粉，其它成分同PDA培養基。

1.2 鉤狀木霉菌對辣椒疫霉菌的拮抗試驗

1.2.1平板對峙法 鉤狀木霉菌和辣椒疫霉菌活化5 d后，用直徑為5 mm的打孔器各取一個菌餅置于相距5 cm的PDA平板中心兩側，使鉤狀木霉菌和辣椒疫霉菌之間距離約為5 cm，5個重復，以單接種辣椒疫霉菌為對照，用封口膜封口，28 ℃黑暗培養5 d。

1.2.2抑菌圈法 取6個直徑為5 mm的鉤狀木霉菌菌餅接種于120 mL PDB培養液中，150 r·min-1、 28 ℃振蕩培養6 d，經3層滅菌紗布過濾后，得到的上清液分為2 份，一份7 830 r·min-1離心10 min后，再經孔徑為0.22 μm濾膜過濾處理，另一份不做任何處理；將上述兩種處理的上清液分別取4、6 和8 mL濾液加入100 mL PDA培養基中，混勻倒平板，待平板冷卻后，取直徑為5 mm的辣椒疫霉菌菌餅接種于含不同濃度的鉤狀木霉菌發酵液的PDA平板上，以不加鉤狀木霉菌發酵液的PDA培養基為對照，5個重復，25 ℃培養5 d。

生長抑制率= (對照菌落直徑-處理菌落直徑)/ 對照菌落直徑×100%

1.2.3顯微觀察法 活化5 d的辣椒疫霉菌與鉤狀木霉菌接種于PDA平板的中心兩側，兩個菌餅中間放置2片滅菌處理的蓋玻片，28 ℃黑暗培養至兩側菌絲接觸生長。用鑷子將培養基上長有菌絲的蓋玻片取出，制成水玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 鉤狀木霉菌對辣椒疫病的生物防治試驗

1.3.1辣椒種子催芽及辣椒苗培育 挑選籽粒飽滿、大小均勻的辣椒種子，表面消毒(3% NaClO，1 min；75% 酒精，1 min)后備用。將消毒后的種子均勻平鋪在鋪有滅菌紗布的保鮮盒中，覆蓋一層滅菌紗布，加入適量的無菌水使紗布濕潤，密封，28 ℃黑暗下催芽。待種子萌發出白色根尖后播種于裝有滅菌營養土的育苗缽中，長至4葉期和六葉一心時備用。

1.3.2鉤狀木霉在辣椒根際土壤中的定殖 將鉤狀木霉活化培養6 d后，加無菌水洗木霉菌培養平板，制成分生孢子懸浮液，血球計數板計數調整濃度為1×106conidia·mL-1。取2 mL分生孢子液加入到120 mL PDB培養液中，28 ℃，150 r·min-1振蕩培養6 d，4層滅菌濾紙過濾，調整其濃度為1×107conidia·mL-1。取上述4葉期辣椒幼苗，灌根接種10 mL鉤狀木霉菌的孢子懸浮液，26/22 ℃，14 h光照/10 h黑暗交替培養。

上述處理培養后，每隔24 h取樣制備根、莖和葉片組織水玻片，通過熒光顯微鏡觀察記錄，并每隔8 d進行一次辣椒植株根際土取樣，觀察木霉菌根際定殖動態。首先將辣椒植株從花盆中整體輕輕取出，去除根外圍土壤，收集辣椒根際土壤，室溫靜置風干；取5 g土樣加入50 mL無菌水，并于28 ℃，150 r·min-1振蕩1 h，使土壤中的微生物均勻分散，靜置20～30 s后，取土樣稀釋液滴于血球計數板，熒光顯微鏡下鏡檢并統計鉤狀木霉菌分生孢子，計算孢子數量。

稀釋液孢子數 (conidia·mL-1)=400個小格菌總數×104×稀釋倍數

孢子數 (conidia·g-1)=(每毫升稀釋液的孢子數×稀釋土壤用水量)/土壤重量

1.3.3鉤狀木霉菌對辣椒植株的促生

①辣椒疫霉菌接種液準備：將辣椒疫霉菌活化培育5 d后，用孔徑為5 mm打孔器挖取菌餅，取6個接種于120 mL PDB培養液中，150 r·min-1、25 ℃振蕩培養7 d，通過粉碎攪拌器將菌絲打碎制成菌懸液，備用。

②取六葉一心的辣椒幼苗，首先按上述方法準備濃度為1×107conidia·mL-1的鉤狀木霉菌孢子懸浮液，取15 mL灌根接種于辣椒幼苗根圍土壤中，并將其移栽到花盆中。定殖生長7 d后，再取15 mL上述辣椒疫霉菌懸液接種于辣椒幼苗根圍。試驗設單接種辣椒疫霉菌懸液(PC)、接種鉤狀木霉菌和辣椒疫霉菌孢子懸浮液(Th+PC)兩個處理，以PC為對照，每個處理15盆，共30盆。

上述處理的辣椒植株置于小溫室中培養，培養條件：26/22 ℃，14 h光照/10 h黑暗交替。每天滅菌蒸餾水澆水一次，每盆大約5 mL。17 d后，選擇健康植株測定辣椒植株的株高、根長、莖粗、鮮重和干重等數據。

促生率=(處理植株干重-對照植株干重)/對照植株干重×100%

1.3.4鉤狀木霉菌對辣椒疫病的防治 辣椒種子催芽和育苗方法同1.3.1。試驗設置2個處理，以單接種辣椒疫霉菌懸液為對照，接種20盆，同時接種鉤狀木霉菌和辣椒疫霉菌的處理51盆，共71盆。接種處理后，每隔24 h取不同處理的辣椒幼苗，徒手切片，制備根、莖和葉片組織的水玻片，在熒光顯微鏡下觀察，每次取2株，同時記錄辣椒植株病害情況，病害調查及分級標準按照方中達[25]方法進行。

病害分級標準：0級—完全無病；1級—外葉莖部有局部病癥 (黑褐色至黑色、溢縮)；2級—外葉莖部溢縮變色部分在1/3以下，或外葉少數蔫萎 (脫落)；3級—全株1/3以上出現溢縮變色，或倒伏，葉片脫落，枯死。相關指標計算公式如下。

發病率=(發病株數/調查總株數) ×100%

防治效果=(未發病株數/調查總株數) ×100%

病情指數=[Σ(各級株數 × 各級代表值)/(調查總株數×最高級值)] × 100%

1.4 數據統計與分析

數據均采用Microsoft Excel 2010和DPS 7.05軟件進行數據分析及方差分析，并用LSD法進行顯著性(P<0.05)差異分析。

2 結果與分析

2.1 鉤狀木霉菌對辣椒疫霉菌的抑制效果

對峙培養6 d，鉤狀木霉菌對辣椒疫霉菌生長抑制率可達49.8% (圖1B)。通過抑菌圈法試驗，當鉤狀木霉菌發酵液 (107conidia·mL-1的孢子懸浮液) 的加入量為6 mL時，其分生孢子能夠完全抑制辣椒疫霉菌的生長 (圖1C、1D)，而當加入經濾膜過濾的無孢子的發酵液則沒有拮抗辣椒疫霉的作用 (圖1E、1F)，說明木霉發酵液沒有產生抑制疫霉的代謝物。通過熒光顯微鏡觀察 (圖2)發現，鉤狀木霉菌菌絲能夠依附或纏繞在辣椒疫霉菌菌絲上生長，同時還發現大量鉤狀木霉菌分生孢子附著在辣椒疫霉菌菌絲上。

2.2 鉤狀木霉菌在辣椒根際中的定殖動態

灌根接種處理后，辣椒幼苗根際土壤中的鉤狀木霉菌的定殖量出現動態變化(圖3)。在第1～25 d時，緩慢增長，第25 d后，出現急劇增長，接種第33 d時，鉤狀木霉菌的數量達到最大值，約為7.00×107conidia·g-1，然后定殖數量逐步下降，在第41 d，約為5.29×107conidia·g-1(圖3C)。試驗結果表明，鉤狀木霉菌能夠在辣椒根際土壤中定殖和生長繁殖，呈現先增加后降低的動態變化過程。

2.3 鉤狀木霉菌對辣椒植株的促生作用

辣椒植株的株高、根長、莖粗、鮮重及干重結果(表1)表明，與單接種辣椒疫霉菌的對照相比，接種鉤狀木霉菌的辣椒幼苗的根長、鮮重、干重和含水量均顯著升高，分別增加134.25%、111.97%、52.63%及121.14%。結果表明，鉤狀木霉能夠有效促進辣椒植株的生長，促生率達到52.63%。

表1 鉤狀木霉與辣椒疫霉菌互作對辣椒植株生長的影響Table 1 Effects of the interaction between T. hamatum and P. capsici on the growth of pepper plants

2.4 鉤狀木霉菌對辣椒疫病的生防作用

2.4.1鉤狀木霉菌在辣椒植株中定殖 鉤狀木霉菌在辣椒植株的定殖結果見圖4，可見，接種后24 h，鉤狀木霉菌在辣椒幼苗的根表皮定殖 (圖4C、4D、4E)；第3 d，鉤狀木霉菌在辣椒植株根部維管束中大量定殖并自內向外定殖于根部韌皮部 (圖4F)，部分可直接定殖于辣椒根部表皮 (圖4G)；第7 d，在主根與須根連接處的橫切面和縱切面，可觀察到大量木霉熒光菌絲定殖于根莖交接處 (圖4H、4I)。接種7 d后，辣椒莖部表皮 (圖4J) 及莖部木質部 (圖4K) 有大量鉤狀木霉菌絲聚集，而且在辣椒植株的葉片 (圖4L) 和葉柄 (圖4M) 都能夠檢測到鉤狀木霉菌絲。結果表明，鉤狀木霉菌在辣椒植株的根、莖和葉組織中都能夠定殖共生。

2.4.2鉤狀木霉菌對辣椒疫病的防治效果 直接對辣椒灌根單接種辣椒疫霉菌菌懸液2 d后，辣椒幼苗近地面莖部開始皺縮褐變；4 d后，辣椒幼苗大部分葉片開始萎蔫；5 d后，所有葉片都萎蔫且近地面的葉片開始脫落；7 d后，辣椒大部分葉片脫落，植株完全萎蔫；10 d后，干枯死亡 (圖5)。

防治效果數據(表2)表明，單接種辣椒疫霉菌的處理中辣椒疫病的病情指數達到80.00%，而同時接種鉤狀木霉菌和辣椒疫霉菌的處理中辣椒疫病的病情指數明顯降低，與對照相比，病情指數下降了50%，防治效果為53.33%。

表2 鉤狀木霉對辣椒疫病的防治效果Table 2 Control efficiency of T. hamatum against pepper Phytophthora blight

3 討論

生防木霉菌能夠通過重寄生或產生揮發性和非揮發性抑菌化合物達到防控辣椒疫霉作用[17-19]。有些木霉種類作用于植物會表現出促進植物生長的現象。Chang等[26]通過哈茨木霉分生孢子液處理胡椒、長春花和菊花等植物的種子或根部后發現，胡椒的發芽率提高，長春花的花期提前，菊花的花朵數量增多，并且這些植物的株高及鮮重都有所增加，而番茄、黃瓜和胡椒干重也有明顯增加。而Contreras-Cornejo 等[27]發現，綠色木霉和深綠木霉 (T.atroviride) 與擬南芥互作使野生型擬南芥生長加速，側根增多，該過程與生長素含量增加有關。本研究通過熒光標記的鉤狀木霉對辣椒疫霉菌的互作抑制作用,證實了鉤狀木霉能夠通過競爭作用抑制辣椒疫霉菌的生長，且木霉菌絲體能夠依附或纏繞在疫霉菌絲上生長，其分生孢子也可附著在辣椒疫霉菌菌絲上并萌發，同時，鉤狀木霉還能夠對染病辣椒有積極效果，能夠有效促進受病害侵染后植株(包括根系及生物量等)的生長(表1)。鉤狀木霉促進辣椒植株生長發育的作用機制，還待進一步研究。

木霉菌不僅在土壤中廣泛存在，也可在植物根、莖、葉的表面及組織內定殖。作為生防木霉菌在宿主植株及根際中定殖能力是評價其潛在生防能力一個重要標準[28]。本研究表明，鉤狀木霉ACCC31649-GF21 能夠通過菌絲和孢子在辣椒不同組織中定殖，可通過側根、根毛和根表皮的自然孔口或氣孔侵入辣椒植株根內，經皮層到達根維管束系統。木霉菌能夠成功進入宿主植物組織并與宿主形成一種和諧共生關系，這是一個復雜的過程。在這個過程中，木霉菌會產生多種化學物質以協助自身完成在植物表面和內部的生長和繁殖，其中大多是蛋白和多肽類物質，包括幾丁質酶、蛋白酶、纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶等，這些酶類可以降解植物細胞壁以幫助木霉菌侵入和定殖，如哈茨木霉分泌的纖維素酶可以降解植物的細胞壁，從而使其進入到玉米根部的皮層組織中，纖維素酶的持續產生加速了木霉的定殖過程[29]。同時，木霉菌在植株及根際土壤中定殖是一個復雜的動態過程，會受到多種因素的影響，包括溫度、土壤pH以及棲息微生物等[30-31]。已有研究表明，木霉菌在與棲居微生物競爭時，因有較強的定殖能力而具有明顯的優勢，從而有效抑制病原菌生長[23,32-33]。本研究通過GFP標記的鉤狀木霉菌，利用熒光顯微鏡直接對鉤狀木霉菌在辣椒根際和辣椒組織中進行實時動態定殖研究，發現鉤狀木霉菌能在辣椒根際土壤中長時間定殖和生存，呈現逐步增長達到一個最大數值，然后逐步下降的動態變化過程。杜嬋娟等[34]也對土壤垂直和水平空間的木霉定殖特點進行了研究，并探討了土壤含水量和pH對木霉在土壤中的定殖數量變化影響。本研究結果為生防木霉菌與辣椒病害及宿主辣椒植物之間的互作和生防作用的進一步研究提供了重要的科學依據和理論基礎，也為木霉菌劑在土壤中的施用方式、施用條件及間隔時間等田間應用提供科學指導和借鑒。