北蒼術枝枯病病原菌(Fusarium equiseti)的鑒定及其生物學特性研究

溫曉蕾, 齊慧霞, 孫偉明, 劉一健, 馮麗娜,孟童瑤, 韓志玲, 曹佳, 王俊鳳

(1.河北科技師范學院農學與生物科技學院, 河北 秦皇島 066600;2.河北農業大學植物保護學院, 河北 保定 071001; 3.北京林業大學林學院, 北京 100083)

鐮刀菌是世界性分布的真菌，種類繁多，可侵染多種寄主植物，其寄生繁殖能力強，大部分對寄主植物具有致病性并引起毀滅性病害。木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)是鐮刀菌的一種，能產生毒素，在熱帶及亞熱帶地區常見，被認為是一種致病力較弱的病原菌。近年來，由于氣候環境的影響，逐漸演變成致病力較強并能侵害多種寄主的病原菌[1]。主要危害作物的種子、根、莖及果實，并表現出不同的危害癥狀。目前,國內外已報道該病原菌能引起黃蜀葵莖枯病[2]、頭花蓼莖枯病[3]、甜椒莖根腐病[4]、西瓜果實腐爛病[5]、甜哈密瓜果實腐爛病[6]、大白菜枯萎病[7]、煙草根腐病[8]、火龍果果柄腐爛病[9]等，給農業生產帶來了巨大的經濟損失。

北蒼術是我國主要栽培中藥材，隨著其越來越多的藥用價值被發現，國內外市場需求量日益增加[10]。然而在不斷擴大北蒼術種植面積的過程中，引發了各種病害的發生，種類繁多，給生產造成了嚴重的損失。2017年,在秦皇島昌黎縣泥井鎮調查過程中發現蒼術有枝枯現象，嚴重時能引起蒼術莖枯死，甚至整株死亡的現象，并有逐漸蔓延和相互傳染趨勢。為了查明該地區蒼術枝枯死苗的原因，對病原菌進行了分離、形態學、分子生物及致病性的鑒定，最終確定該病原菌是一種木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)。1990年，徐友貴等[11]曾對由木賊鐮刀菌(Fusariumegulseiti)引起的茅蒼術枯萎病進行了報道，但并沒有對其生物學特性等方面進行詳細的研究。本研究確定其病原菌類型后，測定了不同碳氮源、pH、溫度、光照等因素對其菌絲生長及產孢的影響，旨在明確其生長發育條件，為生產中有效控制病害的發生與流行提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病害樣本在河北省秦皇島昌黎縣泥井鎮北蒼術種植基地采集，記載危害癥狀特點，使用自封袋封好，帶回實驗室，并保存于 4 ℃冰箱備用。

PSA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

2×Mix 試劑盒(lot 01032/50334)，瓊脂粉(Solarbio Cat#A8190 1214X021)購自北京康為世紀有限公司。

主要儀器有電熱鼓風干燥箱(GZX-914MBE，上海博訊實業有限公司醫療設備廠)、立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-75G，上海云泰儀器儀表有限公司)、PCR儀(AG 6331CQ105783，Eppendorf)、電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)。

1.2 病原菌的分離純化

病原菌的分離純化采用組織分離法[12]，即取蒼術莖部病、健交界處，剪切4～5 mm的小塊，用75%的酒精消毒30 s，滅菌水清洗3次后接種于PSA平板上，每皿3～4塊，置于25 ℃培養箱中培養3～4 d，再純化菌株。

1.3 病原菌形態學鑒定

將病原菌接種到PSA培養基上，在25 ℃恒溫培養箱中培養7 d后，觀察菌落顏色、形狀、大小，分生孢子的有無、形態及產生方式，厚垣孢子的有無及著生方式等形態特征，進行形態學鑒定[13]。

1.4 病原菌分子鑒定

將純化后的病原菌接種到PSA培養基，于25 ℃恒溫箱中培養3 d，收集菌絲用于分子鑒定[14-16]，利用康為試劑盒提取病原菌DNA。通過紫外可見分光光度計測定其濃度。用1%的瓊脂糖凝膠檢測DNA。測序序列拼接后在NCBI基因庫Blast比對。

PCR擴增：采用ITS序列(ITS1:2012519908;ITS2: 2012519909)通用引物ITS1/ITS4對真菌核糖體基因轉錄間隔區域進行PCR擴增，引物序列ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

擴增總體系為25 μL：2×TaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。

PCR擴增程序為：熱蓋溫度為105 ℃，94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 33個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃恒溫保存。得到ITS擴增產物后，用1.0%瓊脂糖凝膠檢驗擴增產物，PCR產物樣品合格后送上海生工生物工程有限公司測序。

序列分析：將測序結果通過DNAMAN軟件進行序列拼接，并將所得序列與GenBank中的ITS序列進行分析比對。通過MEGA7.0軟件構建系統發育樹，更準確地鑒定病原菌的種類。

1.5 致病性測定

采用活體傷口接種法[17-18]測定致病性。選擇健康無病的蒼術，取其上、下部位莖，以75%的酒精對蒼術莖部進行表面消毒，再用無菌水沖洗、晾干。用消毒的刀片在葉片及莖部劃出傷口，將在PDA上培養7 d的病原菌，使用打孔器取直徑5 mm的菌餅貼在滅菌脫脂棉上，將脫脂棉分別貼在枝條傷口處，并用保鮮膜纏繞包裹，同時接種無傷口葉片及莖，以無菌PDA菌餅作對照，每個處理接種3株，保濕培養24 h，去掉菌餅，觀察發病情況。從接種發病的葉片及莖部上再次分離病原菌，完成柯赫氏法則驗證。

1.6 病原菌生物學特性研究

1.6.1培養基 將直徑為 5 mm的病原菌菌餅移轉接到PDA培養基、燕麥培養基、PSA培養基和玉米培養基平板中央，每個處理3次重復，于25 ℃恒溫箱中培養7 d，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.6.2溫度 選用PSA作為基礎培養基，將菌餅(5 mm)接種于平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養箱中培養7 d，觀察與測量菌落直徑。

1.6.3pH 使用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl調節培養基的pH為4、5、6、7、8、9、10、11，轉接病原菌菌餅(5 mm)于PSA培養基中央，25 ℃恒溫培養7 d,觀察與測量菌落直徑。

1.6.4光照 將病原菌菌餅(5 mm)移轉接到PSA平板，培養條件為24 h全黑暗、24 h全光照、12 h光暗交替，于25 ℃恒溫培養7 d，觀察與測量菌落直徑。

1.6.5碳源和氮源 碳源篩選：以PSA為基礎培養基，分別用等量的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉、D-木糖醇代替蔗糖作為唯一碳源。

氮源篩選：以PSA為基礎培養基，用酵母浸出液、牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硝酸鉀、硫酸銨和尿素作為氮源。

將病原菌菌餅(5 mm)轉接于平板中央，于25 ℃培養7 d，觀察與測量菌落直徑。

2 結果與分析

2.1 病原菌的鑒定

2.1.1病原菌形態學鑒定 北蒼術主要受害部位在莖部，發病時莖部多處變褐，病、健交界明顯，嚴重時蔓延到整個植株，直至枯死。病株最初莖基部失綠，然后向上逐漸蔓延，整株發黃枯死，葉片不脫落。橫切病株基部，維管束變褐色。

在25 ℃恒溫條件下，致病菌在PSA 培養基上初期氣生菌絲呈絨毛狀至棉絮狀，顏色為白色至粉紅色，之后發展為淺駝色菌絲(圖1A、B)，可長橘黃色分生孢子座，基物表面黃色至淡褐色，最終變為土黃色。小型分生孢子少，大型分生孢子鐮刀型，彎曲，中部細胞顯著膨大，頂孢延長呈錐形，3～7個隔膜，多數為3～5個分隔(圖1C)，1～2隔膜的大小為(11～38.5) μm×(3～4.5) μm，3～4隔膜的大小為(16.5～87.5) μm×(3～6) μm。厚垣孢子呈球形，直徑6～9 μm，成鏈狀或單生于菌絲或孢子中，產孢細胞單瓶梗，分枝或不分枝(圖1D)。

2.1.2致病性測定 致病性測定結果表明，接種后第3 d植株開始發病，接種莖部變為淺褐色，由于高濕度條件，病部逐漸加重，病斑顏色由淺褐色逐漸變深褐色，到第8 d植株莖部明顯變褐枯死，無接種病菌的對照組植株均未發病且生長良好。用常規組織分離法再次分離病原物，所得真菌與用來接種的病菌相同，證實其為致病菌。

2.1.3病原菌分子鑒定 針對真菌ITS基因序列對分離菌株進行PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條大小約 500 bp 的片段，經測序確定長度為 513 bp，并將序列提交GenBank(Accession No. MH290363)。Blastn比對顯示該病原菌的ITS序列與木賊鐮刀菌Fusariumequiseti(GenBank accession No. MK621018)的相似性達到100%。采用MEGA X.軟件構建的系統發育樹(圖2)，發現分離的菌株與Fusariumequiseti在同一個分支上，且相似性為100%。

2.2 病原菌最佳培養條件的篩選

2.2.1培養基對菌絲生長的影響 由圖3可知，病原菌(Fusariumequiseti)在4種培養基上均能正常生長，其中燕麥及玉米面培養基最適合病原菌的生長，到第7 d時，菌落直徑均為8.50 cm，其次為PSA培養基，菌落直徑均為7.48 cm，在PDA培養基上生長最慢。

2.2.2溫度對病菌菌絲生長的影響 溫度對病原菌(Fusariumequiseti)的影響如圖4所示,病原菌在溫度為10～35 ℃時均能生長，其最適生長溫度為25～30 ℃，其菌落直徑分別為7.43、7.77 cm，在溫度為35 ℃時，菌落生長略顯緩慢，到第7 d時，菌落直徑為6.76 cm；當培養溫度低于25 ℃時，不利于病原菌的生長，尤其是在低溫5 ℃時，病原菌基本停止生長。

2.2.3pH對病菌菌絲生長的影響 通過調節培養基的pH來測定木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)在不同酸堿條件下生長情況，結果發現,其在pH 4～11時均能正常生長(圖5)，該病原菌在8～11時最適合菌絲生長，第7 d時，菌落直徑均在8.00 cm以上。

2.2.4光照對菌絲生長的影響 由圖6所示，木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)喜光，在光照條件下有利于病原菌的生長，尤其是在全光照(24 h)條件下，最適合病原菌菌絲的生長，第7 d時，其菌落直徑8.00 cm，全黑暗不利于病原菌的生長。

2.2.5碳源、氮源對菌絲生長的影響 病原菌(Fusariumequiseti)對7種不同碳氮源的利用如表1所示：病原菌在7種碳源上均能正常生長，分別在含有淀粉、葡萄糖、D-木糖醇的培養基上菌絲生長最好，第7 d菌落直徑分別為7.05、6.88、6.62 cm；對氮源酵母浸出粉利用率最高，7 d時菌落直徑為8.50 cm，其次為尿素；牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨不利于該致病菌菌絲的生長。

表1 碳源、氮源對菌絲生長的影響Table 1 Effect of different carbon and nitrogen sources on mycelium growth

3 討論

試驗采用形態學特征及分子生物學相結合的方法，明確了引起北蒼術枝枯病的致病菌為木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)，該病原菌分布廣泛，能引起多種植物的病害。通過對其進行生物學特性研究時發現，該病原菌最適培養基為燕麥及玉米面，在溫度為 25～30 ℃、pH為8～11、全光照條件下生長最快，并且對碳源淀粉、葡萄糖及氮源酵母浸出粉利用率最高，培養7 d時菌落直徑在7 cm左右。2017年，秦云霞等[19]對引起橡膠樹基腐病木賊鐮刀菌的生物學特性分析結果表明，菌株Fusarium-Hb適宜生長溫度為16～35 ℃，pH 4～11均能生長，在光照條件下菌絲生長最快，對碳源葡萄糖、蔗糖及麥芽糖利用最好，這與本研究結果基本一致。但菌株Fusarium-Hb對氮源硝酸鉀利用最好，這與本研究結果有所不同，產生這種現象的原因可能是由于不同地域而導致菌株對氮源利用有所不同。木賊鐮刀菌也能引起辣木枝枯病，康訊等[20]對該病原菌生物學特性進行研究，結果表明，菌絲生長適宜條件為溫度25～30 ℃，pH 6～8，光照有利于菌絲的生長，與本研究結果相似。但金社林等[21]研究發現，引起玉米穗腐病的木賊鐮刀菌菌絲生長的最適生長溫度為25 ℃，黑暗條件下菌絲生長最快，這與本研究結果不同，產生這種差異可能與當地的氣候條件有關。

本文對引起北蒼術枝枯病病原菌進行了較為系統的研究，對生產上防控病害的發生具有指導性意義。目前對北蒼術病害的研究較少，為了更好的服務于生產，本研究后續將對枝枯病病原菌的侵染循環、發生規律以及藥劑篩選等試驗進行下一步研究，為生產上能更好的防控該病害提供理論依據。