新疆庫爾勒地區羊源產志賀毒素大腸桿菌及其耐藥性分析

劉英玉, 朱明月, 蘇曉月, 胥蘭, 劉俊飛, 鄭曉風, 張妍, 鄭曉琴

(新疆農業大學動物醫學學院, 烏魯木齊 830052)

產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli，STEC)是一類新發高致病性食源性病原菌，攜帶了前噬菌體編碼的一種或兩種志賀毒素基因，可引起人類水樣腹瀉、出血性腸炎及溶血性尿毒癥等疾病[1-2]。前期研究主要是血清型O157∶H7大腸桿菌，但目前許多國家非O157大腸桿菌的流行已超過O157大腸桿菌[3]。STEC毒力基因編碼許多毒力基因，志賀毒素(Shiga toxin，stx)是最主要的毒力基因。國際社會將stx列入生物武器核查清單之一，stx是潛在的生物毒素戰劑和生物恐怖病原[4]。在大腸桿菌中具有溶解致死作用的是stx，前噬菌體編碼的stx基因插入到大腸桿菌染色體基因組中，前噬菌體具有轉導能力，使受體菌獲得了志賀毒素的能力，stx家族研究最多的主要是stx1和stx2兩種[5]。粘附素(eae)是僅次于stx,具有極強致病力的毒力因子，由LEE毒力島編碼，能使細菌黏附于宿主細胞膜[6]。腸溶血素(hly)是一種溶血素，可造成宿主多種類型細胞的細胞膜損傷，誘導產生炎癥細胞因子[7]。

大腸桿菌耐藥性的報道越來越多，胡彬等[8]報道了山東省部分地區23株豬源非O157 STEC菌株對磺胺異唑和復方磺胺異唑、萘啶酸、氯霉素、四環素等抗生素耐藥率比較高。其主要原因是用藥過程中抗菌藥物的濫用和不合理使用，使細菌的耐藥性不斷增加，并且多重耐藥問題更加突出。耐藥的大腸桿菌對家畜的健康產生危害，還可通過環境的污染影響家畜健康，從而對人類的健康產生威脅[9]。新疆是我國五大牧區之一，牛、羊養殖業是新疆現代畜牧業發展的主導產業。牛、羊等反芻動物是STEC的貯存宿主，國際相關研究發現其攜帶率可高達71%以上，STEC感染人導致的疾病也越來越多，引起世界廣泛關注，前期已報道新疆牛源中STEC的污染情況[1]。新疆庫爾勒是發展“絲綢之路”的樞紐地區，本研究選取新疆庫爾勒地區的羊產業鏈，對屠宰場的肉樣和胴體拭子、市場的肉樣和加工用具拭子、養殖場的肛拭子等樣品進行STEC的分離鑒定，檢測STEC中毒力基因情況和抗生素的耐藥情況，以期為新疆地區羊源STEC的污染監測提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1菌株 STEC O157∶H7 CICC21530標準菌株由新疆農業大學動物醫學學院況玲教授提供。

樣品信息：2017年春季庫爾勒定點屠宰場樣品肉樣和胴體拭子各19份和32份，2017年春季庫爾勒農貿市場肉樣、工具拭子及胴體拭子各20份和26份；2018年春季在庫爾勒市郊區某規模化養殖場的兩個育肥場采集肛拭子各86份和63份，繁殖場采集肛拭子36份，共計采集肛拭子185份。羊肉生產環節合計282份樣品。

1.1.2試劑 LB肉湯、伊紅美蘭瓊脂、麥康凱培養基、Mueller-Hinton培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司；TaqMaster Mix、DNA Marker 2000、瓊脂糖、EZ-Vision DNA染料購自新疆寶信生物有限公司；革蘭氏陰性桿菌藥敏試劑盒均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3儀器 YJ-875醫用凈化工作臺購于蘇州凈化設備公司，THZ-02型臺式恒溫振蕩器購于中國科學院新疆分院科學儀器廠，電熱恒溫培養箱購于上海一恒科學儀器有限公司，LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋購于上海申安醫療器械廠，Bio-rad T100梯度PCR儀、移液器、高速離心機均購于德國Eppendorf公司，制冰機購于日本三洋有限公司，電子天平購于梅特勒-托利多儀器有限公司，凝膠成像儀購于美國伯樂公司，水平電泳槽和DYY-6C型電泳儀購于北京六一儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1菌株的分離和鑒定 拭子樣品中大腸桿菌的分離鑒定：取拭子樣品置于5 mL LB肉湯中，37 ℃培養18～24 h，劃線于伊紅美蘭瓊脂上，觀察瓊脂上的紫紅色金屬光澤菌落后，挑取單菌落劃線于麥康凱瓊脂上純化，并對單菌落采用革蘭氏染色法進行鏡檢，將鑒定完成的菌株挑取單菌在LB肉湯中培養18～24 h后，用30%甘油進行保菌備用。

肉樣中大腸桿菌的分離鑒定：按照《GB/T4789.3-2016食品衛生微生物學檢驗——大腸菌群計數》[10]檢驗方法中規定的肉樣處理方法進行分離，同時挑取具有典型大腸桿菌特征的單菌落用革蘭氏染色法鏡檢，將鑒定純化的單菌落于LB肉湯中培養18～24 h后，用30%甘油進行保菌備用。

1.2.2PCR檢測 ①PCR擴增引物。引物參考Bai等[11]的stx等毒力基因引物設計方法，由上海生物工程服務有限公司合成(表1)，引物的使用濃度10 μmol·L-1。

表1 PCR引物序列和擴增長度Table 1 PCR primer sequence and amplification length

②PCR檢測方法。采用煮沸法制備細菌DNA模板，離心后收集上清[12]。

PCR檢測反應體系：共25 μL，TaqMaster Mix 10 μL，引物各1 μL，細菌DNA模板2 μL，ddH2O 11.4 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存產物。

③瓊脂糖凝膠電泳。配制1%瓊脂糖凝膠，取8 μL PCR產物進行電泳檢測，采用凝膠成像系統進行觀察并掃描保存。

1.2.3藥敏紙片檢測 以大腸桿菌ATCC 25922為質控菌株，對STEC進行17種常用抗生素的藥物敏感試驗，結果依照CLSI判定標準進行判定。革蘭氏陰性桿菌藥敏試劑盒中的17種抗生素分別為：卡那霉素、氧氟沙星、哌拉西林、麥迪霉素、氨芐西林、氨曲南、鏈霉素、妥布霉素、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西叮、頭孢噻吩、頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢唑林。用酶標儀測定STEC菌液濃度，將菌液濃度稀釋至OD600值為0.08左右。一個Mueller-Hinton培養基平皿上面用1 000 μL菌液，用滅菌的涂布棒將培養基上面的菌液均勻涂開，用滅菌的鑷子取藥敏片，一個平皿貼6片藥敏片，液體干后倒置放于溫箱中,37 ℃培養24 h后觀察結果。

1.3 數據處理

采用 Excel 2013軟件整理分析數據。

2 結果與分析

2.1 羊肉產業鏈中不同來源樣品的STEC分離鑒定結果

對羊肉產業鏈中的282份樣品進行STEC分離鑒定，結果如表2所示，共檢出72株STEC(肉樣有2株、胴體拭子有1株、肛拭子有69株)，檢出率為22.8%。2017年春季庫爾勒屠宰場中肉樣19份未檢測出STEC；而胴體拭子32份中只檢測出1株STEC，分離率為3.1%。2017年春季庫爾勒市場中肉樣20份檢測出2株STEC，分離率為10.0%；而加工用具拭子26份均未檢測出STEC。2018年春季庫爾勒羊養殖場中育肥場一86份樣品檢測出20株STEC，分離率為23.3%；育肥場二63份樣品檢測出25株STEC，分離率為39.7%；繁育場36份樣品檢測出24株STEC，分離率為66.7%。

2.2 羊肉產業鏈中STEC毒力基因的檢測結果

對分離鑒定的STEC進行毒力基因的PCR檢測，檢測結果見表2。毒力基因以stx1+hly的形式最為常見，其次是stx1+stx2+hly的形式。分別統計STEC菌株毒力基因stx1+stx2、stx1、stx2、rfbE、eae、hly的檢出個數為23、47、2、0、6、4、53個。養殖場中stx以stx1為主，檢出率達到了65.2%(45/69)，72株STEC菌株均為非O157菌株。育肥場一20株STEC中毒力基因stx1+stx2有4個，stx1有14個，stx2有2個，eae有4個，hly有13個；育肥場二25株STEC中毒力基因stx1+stx2有7個，stx1有18個，hly有16個；繁育場24株STEC中毒力基因stx1+stx2有11個，stx1有13個，hly有22個。整體上，毒力基因eae的檢出數量較少，hly的檢出數量較多。育肥場一和育肥場二以stx1為主，檢出率分別為70.0%和72.0%，但是繁育場中以stx1+stx2和stx1為主，檢出率分別為46.2%和53.8%。

表2 羊源STEC及毒力基因的檢測結果Table 2 Detection results of sheep source STEC and virulence genes

2.3 養殖場中STEC耐藥性的檢測結果

對72株非O157 STEC進行藥敏紙片檢測，結果見圖1，整體上藥物敏感為中介的菌株數量較少，大部分菌株是敏感，但有一些菌株存在耐藥性。主要的耐藥抗生素有麥迪霉素(55株，76.4%)、氨芐西林(16株，22.2%)、鏈霉素(16株，22.2%)、頭孢呋辛(12株，16.7%)、頭孢西叮(19株，26.4%)、頭孢噻吩(34株，47.2%)、頭孢唑啉(16株，22.2%)。

圖2顯示了非O157 STEC菌株多重耐藥情況，最多存在耐9種藥的菌株(3%)，不耐藥的菌株只有8%，大部分菌株都具有耐藥性，耐1種和耐2種的分別有24%和22%，其次耐3種、耐4種、耐5種的分別有14%、11%、10%。

3 討論

3.1 羊肉產業鏈中養殖場是STEC污染的源頭

羊肉污染可以發生在羊養殖、屠宰和銷售的各個環節，通過對整個食品生產過程進行全程控制來減少食源性疾病的發生。目前，逐漸形成了實行從農場到餐桌的食品衛生質量監控體系[13]。本研究首先檢測了屠宰場和市場中肉樣和胴體拭子、加工用具拭子樣品中STEC及其毒力基因的污染情況，發現屠宰場胴體拭子中存在STEC，而肉樣沒有STEC，分析胴體表面因屠宰加工產生了污染；銷售市場中的肉樣存在STEC，說明銷售的其他環節還存在污染。付竹霓[14]研究食源性疾病微生物的三模塊調查分析影響食源性疾病暴發的主要危險因素有食品原料污染、食品加工方式、食品加工設備、食品采集季節、操作人員體內攜帶病菌等。通過調查3個羊養殖場的肛拭子發現存在較多的STEC，檢出率達到了37.3%。前期研究報道中，新疆伊犁地區肉牛糞便中STEC的污染達到23.5%[15]。我國也報道了從豬的樣品中分離出大量的STEC，污染達到25.42%[16]，相比較本研究羊糞中STEC的污染率更高。3個養殖場中繁育場的分離率最高，在以后的STEC檢測中需加強對后備母羊的監測。帶菌羊可通過糞便排泄污染當地的食物、草場、水源等，增加了病原菌的傳播機會和范圍，交叉污染和感染是羊肉污染的來源[17]。

3.2 STEC菌株中毒力基因以stx1為主

目前己知的是stx的類型與引起疾病嚴重程度具有相關性。本研究養殖場中stx基因以stx1為主，stx1+stx2和stx2較少。白向寧等[18]研究也表明，河南和黑龍江的29株非O157 STEC存在stx1陽性高達86.2%，與本研究結果一致。stx1基因陽性的菌株占有非O157 STEC的大多數。分析3個養殖場中stx基因數量時，繁育場的stx1+stx2的數量明顯增多，推測stx1+stx2基因在母畜體內比較穩定。在羊產業鏈中，整體上eae基因檢出率偏低，Bai等[19]研究顯示，豬、牛、肉品中301份非O157 STEC菌株中eae基因檢出率。Wang等[20]研究表明，中國東部豬、牛、雞、肉和奶樣品分離的30株STEC O157中hly檢出率為50%；Meng等[16]研究顯示，93份豬源STEC中hly檢出率為15.1%。本研究中hly基因的檢出率要高于上述研究。推測非0157 STEC中以stx1為主，eae不是主要的毒力基因，hly基因等在非O157 STEC致病性方面作用有待驗證。許多不攜帶eae基因或LEE毒力島的非O157 STEC菌株也可以導致出血性腸炎和溶血性尿毒癥等嚴重疾病，不同黏附相關基因在不同血清型STEC菌株中分布情況不同，其引起的疾病嚴重程度也有差異[21]。

3.3 STEC存在較低的耐藥性，但多重耐藥性較為嚴重

耐藥性調查顯示，STEC菌株對β-內酰胺類、氨基糖苷類、大環內酯類抗生素存在較高的耐藥性。本研究的羊源非O157 STEC菌株主要對麥迪霉素、氨芐西林、鏈霉素、頭孢呋辛、頭孢西叮、頭孢噻吩、頭孢唑啉產生耐藥，比郭強強等[22]報道的綿羊源致病性大腸桿菌的耐藥情況還低一些。此外，邵純純[23]研究顯示，山東省不同家禽糞便中分離鑒定的35株STEC存在不同程度的耐藥性，總體上，對β-內酰胺類抗生素耐藥率呈現較低水平，與本研究結果一致。多重耐藥情況與姚曉慧等[9]的研究結果一致，主要以一耐和二耐為主。值得注意的是，多重耐藥性在不斷增加，β-內酰胺類抗生素中有5種抗生素都存在不同程度的耐藥性。